Itogavya / Ответы к итоговой МБ №6 Частная вирусология (КубГМУ Live)

обнаружения вируса гепатита А предложен метод ДНК-зондоа: используют в качестве зонда ДНК с комплементарную РНК.

20. Почему вирусы являются облигатными паразитами?

Облигатные паразиты — организмы, живущие в организме хозяина в анаэробных условиях. Все этапы жизненного цикла микроорганизма связаны с организмом хозяина. Вне организма человека эти микроорганизмы быстро погибают либо не размножаются.

(У вирусов нет собственных белоксинтезирующих систем и отсутствуют собственные энергообразующие системы, следовательно, вне организма им нечем питаться, и они погибают голодной смертью).

И приводим классическое определение вирусов:

Вирусы – особое царство ультрамикроскопических размеров организмов, обладающих только одним типом нуклеиновых кислот, лишенных собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии и являющихся поэтому

абсолютными внутриклеточными паразитами (А. И. Коротяев).

21. С какой целью производится фаготипирование бактерии, например, стафилкокков?

Фаготипирование – это методика определения источников заражения при мониторинге окружающей среды и в частности водоемов.

Суть ее заключается в маркировке инфекционных штаммов бактерий при помощи бактериофагов. Другими словами, фаготипирование необходимо для

идентификации штаммов бактерий, вызвавших тот или иной всплеск инфекционных заболеваний, а также определения состояния водоемов для купания или источников водных ресурсов на предмет их заражения бактериями.

На засеянные "газоном" стафилококки наносятся капли взвеси стафилококковых бактериофагов. Через сутки после инкубации в термостате видны стерильные зоны отсутствия роста бактерий (стерильные "бляшки") в результате размножения бактериофагов, вызывающих лизис этих бактерий.

22. Каким образом можно выделить от больного гриппом возбудителя и установить его серотип?

Реакция Гемагглютинации. Аллантоисную жидкость проверяют на содержание вируса путем агглютинации куриных эмбрионов на стекле (и в пробирках - титрование вируса). Для постановки реакции на стекле к капле вируссодержащего материала добавляют

11

одну каплю 0,5%-ной взвеси эритроцитов. Ре-я проходит в течение 5 мин. Наличие агглютинации свидетельствует о наличии вируса.

РТГА (реакция торможения гемагглютинации). Может быть использована для определения типа вируса или типа и титра АТ. Для определения типа вируса на предметное стекло наносят по одной капле вируссодержащего материала (кол-во капель должно соответствовать кол-ву сыворотки).

В приготовленные капли последовательно вносят по одной капле типовых сывороток. Контролем служит физ раствор и нормальная сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по одной капле 5%-ную взвесь эритроцитов. Затем регистрируют через 5 мин. При соответствии вируса типу сыворотки АТ связывают гемааглютинин вируса и гемааглютинация не наступает (РТГА +). Это реакция может быть поставлена и в пробирках с целью титрования вируса или АТ (антигемагглютининов).

23. Какие Т-лимфоциты обеспечивают защиту организма от вирусов?

В первую очередь на проникновение вируса в организм реагирует система интерферонов и Т-киллерных клеток. Другая особенность формирования иммунитета связана с тем, что вирусы оказывают слабое АГ воздействие на В-лф и для их активирования, пролиферации и дифференцировки необходимо участие Т-хелперов и соответственно представление последними процессированного вирусного АГ (пептидных фрагментов) при участии молекул МНС класса 2. Поэтому роль МФ и др АПК заключается не только в самом фагоцитозе, сколько в процессированиии и представлении АГ.

Однако интерферонов и ингибиторов оказалось недостаточно для защит от вирусов, поэтому природа создала от вирусов, очень мощный механизм защиты на уровне организма. Он представлен прежде всего Т-цитотоксическими лф и другими киллерными клетками. Эти клетки распознают все чужеродные АГ, в том числе и вирусные, представленные им молекулами МНС класса 1. Главное биологическое значение Т-киллерных клеток и заключается в обнаружении и уничтожении любых клеток, инфицированных любым АГ.

24. Как устроен вирус дельта-гепатита. Особенности его нуклеиновой кислоты?

Форма вириона сферическая, диаметр 35-37 нм. Геном – одноцепочечная кольцевая РНК с м.м. 500000 Д. Вирион имеет 2 белка - внутренний и наружный. Внутренний белокHDAg кодируется геном HDV, а наружный –геном HBV, т.е это поверхностный АГ вируса гепатита В HBsAg. В связи с этим полагают, что HDV – это сателлит вируса гепатита В, и для размножения HDV требуется наличие вируса-хозяина (HBV). Различают 3 геноварианта HDV (1,2,3). Заражение происходит парентерально (с кровью и ее

12

компанентами) или от матери к плоду. С HDV связанно большинство молниеносных форм гепатита В и около 30% циррозов печени у больных гепатитом В. Около 5% носителей HBV носителей инфицированы HDV. Основной метод диагностикиобнаружение специфических к HDV АТ(ИФМ, РИФ и др.) или АГ(ПЦР). Вакцинация против гепатита В служит средством профилактики и дельта-гепатита.

25. С какими целями используют бактериофаги в медицинской практике?

Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги могут быть использованы с лечебно-профилактической целью при различных заболеваниях (дизентерия, холера, различные гнойно-воспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные, используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонеллезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний). Фаги широко используют для изучения генетики микроорганизмов.

26. Как устроен вирус полиомиелита и каковы способы заражения этим вирусом?

Полиомиелит — острое лихорадочное заболевание, которое иногда сопровождается поражением серого вещества (от греч. polios — серый) спинного мозга и ствола головного мозга, в результате чего развиваются вялые параличи и парезы мышц ног,

туловища, рук. Заведующий очень любит спрашивать расшифровку

определения полимиелит!

Полиомиелит известен с глубокой древности. Вирусную этиологию болезни доказали К. Ландштайнер и Э. Поппер в 1909 г. Возбудитель полиомиелита относится к семейству

Picornaviridae, роду Enterovirus, виду Poliovirus.

Структура. По структуре полиовирусы — типичные представители рода Enterovirus. РНК-содержащие вирусы.

Морфология: мелкие, просто организованные вирусы, сферической формы, состоят из одноцепочечной РНК и капсида.

Культивирование: Хорошо репродуцируются в первичных и перевариваемых культурах клеток из тканей человека и сопровождается цитопатическим эффектом. В культуре клеток под агаровым покрытием энтеровирусы образуют бляшки.

Естественная восприимчивость человека к вирусам полиомиелита высокая. Входными воротами служат слизистые оболочки верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта. Первичная репродукция вирусов происходит в лимфатических узлах глоточного кольца и тонкой кишки. Из лимфатической системы вирусы проникают в кровь, а затем в

13

ЦНС, где избирательно поражают клетки передних рогов спинного мозга (двигательные нейроны). Инкубационный период продолжается в среднем 7—14 дней. Различают 3 клинические формы полиомиелита: паралитическую, менингеальную (без параличей), абортивную (легкая форма). Заболевание начинается с повышения температуры тела, общего недомогания, головных болей, рвоты, болей в горле.

27. С помощью какой серологической реакции можно определить наличие вируса иммунодефицита в организме человека и в чем сущность этой реакции?

Основным скрининговым методом диагностики ВИЧ-инфекции и особенно выявления вирусоносительства является использование иммуноферментного анализа.

Имеющиеся коммерческие тест-системы просты в употреблении, содержат сенсибилизированные антигеном лунки в планшетах, все необходимые ингредиенты и контроли. В силу своей универсальности этот метод получил повсеместное применение. Демонстрация отечественных тест-систем для иммуноферментного определения антител к вирусу иммунодефицита человека.

Недостатком иммуноферментного метода является то, что нередко он дает ложнопозитивные результаты. Поэтому в случае сомнения такая сыворотка подвергается контрольному испытанию более чувствительными специфичными методами, например с помощью метода иммуноблотинга или иммунопреципитации.

28. Каков механизм реакции торможения гемагглютинации?

РТГА может быть использована для определения типа вируса или типа и титра антител.

Для определения типа вируса на предметное стекло наносят по одной капле вирусосодержащего материала ( количество капель=количеству сывороток).

В приготовленные капли последовательно вносят по одной капле типовых сывороток. Контролем служит физиологический раствор и нормальная сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по одной капле 5%-ной взвеси эритроцитов. Результат регистрируют через 5 минут. При соответствии вируса типу сыворотки антитела связывают гемагглютинин вируса и гемагглютинация не наступает (РТГА положительная). Эта реакция может быть поставлена и в пробирках с целью титрования вируса или антител (антигемагглютининов).

14

29. Какие существуют методы культивирования вирусов? Как типируют (идентифицируют) вирусы?

Небольшая отсылка к вопросу № 8.

Для культивирования вирусов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Эти же методы используют и для культивирования риккетсий и хламидий — облигатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на искусственных питательных средах.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование invitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться invitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активности вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:

1)нейтрализация цитопатического действия;

2)нейтрализация реакции гемадсорбции;

3)изменение проявления цветной пробы;

15

4)задержка (торможение) реакции гемагглютинации;

5)нейтрализация в опытах на животных.

Кроме того, для идентификации вирусов применяют методы иммунофлуоресценции, ДНК – ДНК-(РНК – РНК) – гибридизации, а также ПЦР.

30. Как устроен вирус ВИЧ?

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ, или HIV - от англ. Human Immunodellciency Vims)

вызывает ВИЧ-инфекцию, заканчивающуюся развитием синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД, или от англ. AIDS — Acquired Imniunodeliciency Syndrome).

СПИД характеризуется преимущественным поражением иммунной системы, длительным течением, полиморфностью клинических проявлений, высокой летальностью, передачей в естественных условиях от больного человека здоровому (главным образом, при половых контактах или парентерально с инфицированными ВИЧматериалами, от больной матери плоду, при грудном вскармливании) и склонностью к быстрому эпидемическому распространению. Типичный антропоноз.

Возбудитель ВИЧ-инфекции - лимфотропный вирус, относящийся к семейству Retroviridae роду Lentivirus. Вирус открыт в 1983 г. одновременно французским вирусологом Л. Монтанье и американским ученым Р. Галло.

ВИЧ — РНК-содержащий вирус. Вирусная частица имеет сферическую форму, диаметр 100 нм. Оболочка вируса состоит из двойного слоя липидов, пронизанного («утыканного») гликопротеинами. Липидная оболочка происходит из плазматической мембраны клетки хозяина, в которой репродуцируется вирус. Гликопротеиновая молекула (gp 160), име ющая молекулярную массу 160 кДа, состоит из 2 субъединиц: gp 120 (молекулярная масса 120 кДа), находящейся на поверхности вириона, и gp 41 (молекулярная масса 41 кДа), пронизывающей его липидную оболочку.

Сердцевина вируса имеет конусовидную форму и состоит из капсидных белков р24 и р25 (молекулярная масса соответственно 24 и 25 кДа), ряда матриксных белков (р6, р7) и белков протеазы. Геном образует две нити РНК (состоит из 7900-9800 п.н.), для осуществления процесса репродукции ВИЧ имеет обратную транскриптазу, или ревертазу.

Геном вируса состоит из 3 основных струк турных генов (gag, ро1, env) и 7 регуляторных и функциональных генов (tat, rev, nef, vif, vpr,vpu, vpx).

Ген gag (от англ. group antigen — групповой антиген) кодирует матриксные, капсидные, нуклеокапсидные белки и белки протеазы.

16

Ген ро1 (от англ. polymerase — полимераза) кодирует обратную транскриптазу (р61/р51, р15-РНКазу, р32-интегразу);

Ген env (от англ. envelope лочка) кодирует поверхностный белок gp 120 и трансмембранный gp 41. Функциональные гены выполняют регуляторные функции (reg, tat, nef) и обеспечивают осуществление процессов репродукции и участие вируса в инфекционном процессе (vif, vpu, vpr, vpx).

31. Что такое иммуноболтинг и для какой цели он применяется?

Иммуноблотинг — метод идентификации антигенов или антител. Заключается в следующем. Смесь антигенов инфекционного агента разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле. При этом белки в зависимости от молекулярной массы и заряда, под действием электичского поля мигрируют на разные расстояния от стартовой лунки.

Затем гель накладывают на нитроцеллюлозную пластину и вновь подвергают электрофорезу. Белки из геля мигрируют в поры нитроцеллюлозы и связываются с ней ковалентно. После этого нитроцеллюлозную пластину обрабатывают сывороткой, содержащей специфические антитела к антигенам инфекционного агента. Антитела при взаимодействии с антигенами образуют иммунные комплексы. Несвязавшиеся с фиксированными антигенами в нитроцеллюлозной пластине антитела отмывают.

Локализацию иммунных комплексов осуществляют с помощью конъюгатов антивидовых антител с ферментом и хромогенного субстрата (т.е. проводят реакцию ИФА). При добавлении субстрата происходит его расщепление ферментом и вследствие этого — окрашивание полос преципитации Метод широко используется в качестве подтверждающего (конфирматорного) теста при диагностике ВИЧ- и др. инфекций.

32. Из каких основных этапов складывается процесс взаимодействия ВИЧ с клеткой?

Жизненный цикл ВИЧ состоит из 4 стадий:

1)адсорбция и проникновение вируса путем эндоцитоза в клетку;

2)высвобождение вирусной РНК, синтез ДНК-провируса и интеграция провируса с геномом клетки хозяина;

3)синтез РНК вируса, трансляция и фор мирование вирусных белков;

4)сборка, созревание и высвобождение путем почкования вновь образованных вирионов.

Полный жизненный цикл вируса реализуется всего за 1-2 суток, причем в сутки формируется до одного миллиарда вирусных частиц.

17

33. Какие вирусы являются возбудителями острых респираторных заболеваний (ОРЗ)?

РНК-содержащие:

1.Ортомиксовирусы ( вирусы гриппа А, В, С)

2.Парамиксовирусы( парагриппозные вирусы, вирус эпидемического паротита,вирус ньюкаслской болезни, вирус кори)

3.Пикорнавирусы ( более 110 серотипов риновирусов, а также некоторые серотипы вирусов Коксаки ( А и В) и ECHO)

4.Реовирусы (3-й серотип)

5.Коронавирусы ДНКсодержащие:

6.Аденовирусы ( 41 серотип, из них 8 возбудители ОРЗ)

34. Почему лица, пораженные вирусом иммунодефицита, становятся легко восприимчивыми к различным, даже слабо патогенным, микроорганизмам, иначе говоря, почему у них часто развиваются оппортунистические инфекции?

Причины иммунодефицита: основная причина массовая гибель Т- хелперов. Наступает вследствие: 1) зараженные вирусом Т- хелперы гибнут вследствие апоптоза.

2) Т- киллеры распознаёт и разрушают Т - клетки, инфицированные вирусом или несущие на себе адсорбированные молекулы gp120, а также вирусинфицированные и не зараженные вирусом Т - хелперы, которые образуют симпласты. Вследствие нарушения большого колва Т- хелперов происходит снижение экспрессии мембранных рецепторову В- лимфоцитов к интерлейкину-2 , нарушается синтез различных интерлейкинов, в результате чего нарушается функция системы Т- киллеров.

Происходит подавление активности систем комплимента и макрофагов. Инфицированные макрофагов и моноциты долго не гибнут, но они не способны удалять вирус из организма. Наконец, из - за структурного и антигенного сходства gp120 с рецепторами некоторых эпителиальных клеток организма происходит синтез антирецепторных антител с широким спектром действия. Такие антитела способны блокировать различные клеточные рецепторы и осложняют течение болезни аутоиммунными расстройствами.

Следствием ВИЧинфекции является поражение всех основных звеньев системы иммунитета. Такие больные беззащитны против самых различных микроорганизмов. Это приводит к развитию оппортунистических и опухолевых заболеваний.

18

35. Какие типы антигенной изменчивости вируса гриппа вы знаете и каково их значение в эпидемиологии этой болезни?

Антигенный дрейф - происходит в период между пандемиями у всех типов вирусов (А, В и С). Это незначительные изменения в структуре поверхностных антигенов (гемагглютинина и нейраминидазы), вызываемые точечными мутациями в генах, которые их кодируют. Как правило, такие изменения происходят каждый год. В результате возникают эпидемии, так как защита от предыдущих контактов с вирусом сохраняется, хоть она и недостаточна.

Антигенный шифт - Через нерегулярные интервалы времени (10-40 лет) появляются вирусы с сильными отличиями от основной популяции. Эти изменения серьезно затрагивают антигенную структуру гемагглютинина, а реже и нейраминидазы. В настоящее время механизм образования новых штаммов вирусов гриппа окончательно не ясен. Одна из существующих теорий основана на рекомбинации генов вируса гриппа животных (птиц, свиней) и человека, не имеющему к нему готовых факторов защитыклеточного и гуморального иммунитета. Многие типы животных - это птицы, свиньи, лошади, морские млекопитающие и др. (включая человека), могут быть инфицированы вирусом гриппа А. Некоторые типы вирусов типа А могут инфицировать несколько типов животных. Вирус гриппа содержит 8 молекул РНК. В случае, если в одном организме (например, свиньи) встречаются два разных вируса гриппа, то они могут обмениваться фрагментами нуклеиновой кислоты друг с другом. Другая теория стоит на позициях рецикличного появления вируса в человеческой популяции.

36. Как осуществляется специфическая профилактика бешенства? Какой препарат применяют сейчас для этой цели и в каких случаях?

Профилактика заключается в борьбе с бешенством среди животных и предупреждения развития болезни у людей, подвергшихся укусам или ослюнению больным животным Программа ликвидации:

1.Искоренение городского собачьего бешенства

2.Оздоровление природных очагов рабической инфекции

Перспективным считается оральные антирабические вакцины: живая модифицированная цельновирионная вакцина из аттенуированных вакцинных штаммов ( САДБерн Внуково-32) и рекомбинантная генноинженерная оральная вакцина с использованием в качестве вектора вируса осповакцины, экспрессирующего ген G- протеина вируса бешенства

При укусах или ослюнении необходимо тщательно промыть рану или кожу в месте попадания слюны мыльной водой, рану прижечь спиртовым раствором йода и начать

19

проведение специфической профилактики антирабической вакциной и антирабическим гаммаглобулином. Рекомендована антирабическая инактивированная культуральнаявакцина, которая изготовлена на культуре клеток, инфицированных аттенуированным вирусом бешенства (штамм Внуково-32).

37. По каким признакам можно судить о размножении вирусов в культуре клеток?

Возвращаемся к вопросу № 10 2-ой итоговой 4 семестра.

О наличии и размножения вируса в клетках узнают по так называемому цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки гибнут, и под микроскопом заметны дегенеративные изменения клеток. Пласты зараженных клеток отслаиваются от стенки пробирки или флакона. Так как рост клеток прекращается, pН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса).

38. Какие методы применяют при вирусной диагностики гепатита А?

Кроме заражения животных - шимпанзе, обезьянок-мармозеток, павианов, предложены различные иммунологические методы: РСК, иммунофлуоресцентный метод, гемагглютинации иммунного прилипания ( комплекс вирусный антиген + антитело в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах и вызывает их склеивание).

Надежным специфическим метод иммунной электронной микроскопии, однако он трудоемкий. Поэтому единственной приемлемой иммуннологической реакцией является метод иммуносорбентного анализа твердой фазы в виде ИФМ и РИМ

39. Как проникает в организм вирус гриппа, и из каких основных этапов складывается процесс его внутриклеточного размножения?

Патогенез.

Вирус гриппа попадает аэрозольным путем в цилиндрический эпителий верхних дыхательных путей (ВДП), где проходит короткий инкубационный период.

Далее он выходит в кровь (продромальный период) → по эндотелию капилляров ВДП в ВДП, повреждает эндотелий → кашель, ринит. В результате повышения проницаемости вируса → отек мозга с летальным исходом. После гриппа присоединяются осложнения чаще бактериальной природы.

Репродукция.

Вирусы прикрепляются к чувствительным клеткам верхних дыхательных путей с помощью гемагглютинина, проникает внутрь клетки, теряет часть оболочки, «-»РНК вириона стремится к ядру, в ядре начинается процесс транскрипции и репликации вируса. Для транскрипции РНК необходим КЭП – участок на 5´конце иРНК, который состоит из метилированного гуанидина и 10-13 прилежащих нуклеотидов. КЭП

20