содержание занятия

Ц и т о г е н е т и ч е с к и й м е т о д

Цитогенетический метод применяется при всех состояниях, когда хромосомная аномалия может предполагаться как наиболее вероятный этиологический фактор.

Цитогенетические методы в клинической практике применяют не только для диагностики хромосомных заболеваний, но и при некоторых врожденных состояниях, связанных с повышенной «хрупкостью» хромосом (анемия Фанкони, синдром Блюма, атаксия и телеангиэктазия и др.), для диагностики некоторых онкологических заболеваний.

Цитогенетический метод. Используется для картирования хромосом человека и выделения функционально активного участка ДНК, ответственного

за синтез нормального фермента. Последний может заменить дефектный аналог в соответствующей метаболической цепи и, таким образом, мы вправе говорить о перспективах рациональной терапии многих наследственных заболеваний. Характерные особенности строения каждой хромосомы определяются положением ее центромеры. В районе центромеры хромосома сужена, две ее хроматиды сближены, и этот район образует в теле хромосомы первичную перетяжку. По положению центромеры хромосомы разделяются на метацентрические, у которых центромера расположена в середине, субметацентрические, у которых центромера расположена ближе к одному из концов и хромосома неравноплечна, и акроцентрические, у которых центромера расположена почти на конце хромосомы. У отдельных хромосом (1;9;16) могут быть и дополнительные перетяжки, называемые вторичными, а также спутники – маленькие хроматические тельца, которые характерны для акроцентрических хромосом.

Классификация и номенклатура равномерно окрашенных хромосом человека выработаны на международных совещаниях в Девере (1960), Лондоне (1963) и Чикаго (1966). Согласно рекомендациям этих совещаний и дополнению от 1978 г., хромосомы набора располагаются в порядке уменьшения их длины. Все пары аутосом, расположенные в таком порядке, нумеруют арабскими цифрами от 1 до 22. Половые хромосомы человека обозначают латинскими буквами Х и Y и при кариотипировании помещают отдельно в конце раскладки. Расположенные в указанном порядке все аутосомы распределяются на 7 групп, которые различаются между собой длиной и формой и обозначаются буквами английского алфавита от А до G.

Во многих клеточных ядрах большинства тканей у женщин обнаруживаются уплотнения хроматина, прилегающего к мембране ядра. Это образование, обозначаемое как половой хроматин (или тельце Барра), легче всего выявляется в мазках слизистой оболочки рта. В ядрах клеток у мужчин он отсутствует. Наличие или отсутствие полового хроматина характеризует набор хромосом Х, а следовательно, и пол индивида.

Для того, чтобы изучать хромосомы человека, необходимо иметь представление о способах их получения. Из всех применяемых методов наиболее широко применяется метод Мурхеда (1960) с различными модификациями. Материалом исследования служит периферическая кровь. В присутствии стимулятора митозов фитогемагглютинина (ФГА) лимфоциты активно размножаются. Клетки культивируют при 370С в течение 2-3 суток, а затем в присутствии колхицина или колцемида и гипотонического раствора готовят цитологические препараты. Для равномерного окрашивания хромосом чаще используют краситель Романовского-Гимзы, который дает интенсивное гомогенное окрашивание.

При цитогенетическом исследовании для того, чтобы ответить на вопрос, нормален ли хромосомный набор или имеется какая-либо аномалия, существенное значение приобретает правильный отбор метафазных пластинок. Каковы же требования к такому отбору? Для этого необходимы: цельность метафазной пластинки; отсутствие или небольшое число взаимных

наложений хромосом; средняя степень их конденсации (спирализации); обособленность метафазных пластинок друг от друга. Соблюдая эти правила, можно правильно идентифицировать хромосомы.

Хромосомный анализ включает несколько этапов: визуальный анализ препаратов; зарисовки хромосом; применение фотосъемки и раскладки кариотипа.

Идентификация каждой хромосомы с помощью рутинного метода существенно ограничивала цитогенетическую диагностику и классификацию хромосомных болезней. И только благодаря освоению новых методических подходов к изучению хромосом удалось, наконец, решить этот вопрос. Все хромосомы имеют неоднородную линейную структуру, что выражается в разной окрашиваемости их участников по длине. Рисунок линейной дифференцированности (линейная исчерченность) оказался специфическим для каждой хромосомы, что и обеспечивает их идентификацию в нормальном сбалансированном наборе и при многих структурных хромосомных перестройках. Линейная исчерченность хромосом выявляется дифференциальной окраской после воздействия на них некоторых солевых растворов (со строго определенными величинами рН и температурной) и последующей окраски флюоресцирующими (Q-окраска) или основными красителями типа раствора Гимзы (G- и R- окраска).

Помимо указанных способов окраски, применяют и другие специфические методы, которые позволяют избирательно окрашивать участки тех или иных хромосомных районов. Наиболее информативен метод С-окраски. С его помощью выявляют плотно красящиеся сегменты, расположенные в центромерных или околоцентромерных участках всех хромосом, а также в коротких плечах хромосом 13-15, 21-22 и в длинном плече хромосомы Y. Кроме того,этот метод выявляет так называемый структурный гетерохроматин. Известно, что хроматин клеточного ядра в целом и каждой хромосомы в отдельности разделяется на эухроматин (активные районы, которые содержат гены, контролирующие развитие признаков организма) и гетерохроматин (неактивные районы) и расположение этих районов для каждой хромосомы строго индивидуально. Известно также и то, что структурный гетерохроматин не только не активен, но и содержит очень мало или вовсе лишен структурных генов, определяющих простые признаки, которые наследуются по менделевским законам. Значение данного метода сотоит в том, что он, выявляя структурный гетерохроматин во всех хромасомах, позволяет лучше, чем какой-либо другой метод, оценивать хромосомный полиморфизм у человека.

Применение новых методов дифференциального окрашивания хромосом вызвало необходимость создания единой номенклатуры обозначений в области цитогенетики. Основные рекомендации были даны Парижской конференцией (1971), основываясь на следующих принципах: каждая хромосома рассматривается как непрерывная совокупность сегментов, независимо от их окраски, поэтому «межсегментов» не существует;

плечи хромосом, обозначаемые латинскими буквами «р» (короткое плечо) и «q» (длинное плечо), подразделяются на районы, а районы в свою очередь на сегменты – участки хромосом, четко отличающиеся от соседних по интенсивности окраски;

районы и сегменты нумеруют арабскими цифрами от центромеры к теломере отдельно для каждого плеча. Например, символ 1р22 означает 2-й сегмент в районе 2 короткого плеча аутосомы 1.

Врач должен знать формы записи как нормальных, так и аномальных кариотипов. Для этого необходимо соблюдать следующие правила.

1.Сначала указывают общее число хромосом.

2.Затем указывают состав половых хромосом. Например: 46,ХХ – нормальный женский кариотип, 46,ХY – нормальный мужской кариотип, 47,ХХY – синдром Клайнфельтера.

3.Добавочную аутосому обозначают соответствующим номером и знаком «+». Например, 47,ХY21+ - мальчик с трисомией 21 (синдром Дауна). Утрату целой хромосомы соответственно обозначают знаком " - " . Например, 45,ХY,21мужской кариотип с моносомией 21.

4.Короткое плечо хромосомы обозначают латинской буквой р, длинное плечо-q. Например, 46,ХY,5р – делеция короткого плеча хромосомы 5 (при синдроме «кошачьего крика»).

5.Транслокацию обозначают буквой t с расшифровкой в скобках. Например, 45, ХХ, t (14+21)–женщина – носительница сбалансированной транслокации 14/21.

6.Присутствие более чем одной клеточной линии (мозаицизм) обозначается знаком дроби. Например, 45Х/46, ХХ - мозаик по синдрому Шерешевского - Тернера.

Б и о х и м и ч е с к и е м е т о д ы

Описано более 400 наследственных болезней обмена веществ с идентифицированной биохимической аномалией. Показано, что причины многих врожденных нарушений метаболизма – различные дефекты ферментов, возникающие вследствие генные мутации.

В клинической практике для биохимической диагностики известных болезней обмена используют качественные и полуколичественные методы. С их помощью удается выявить изменения в содержании продуктов обмена. Для анализа используют не только биологические жидкости (кровь, моча), но и клетки больного, культивируемые in vitro. Применяют сложные методы определения содержания фермента, его каталитической активности и молекулярной структуры.

Биохимические методы. Этим методам принадлежит ведущая роль в диагностике моногенных наследственных болезней, так как биохимические показатели (первичный белковый продукт гена, накопления патологических

метаболитов внутри клеток и во внеклеточных жидкостях) более адекватно отражают сущность болезни, чем клинические симптомы, не только в диагностическом, но и генетическом плане.

В практике здравоохранения особое значение приобрели просеивающие

(скринирующие) программы.

Скринирующий подход широко применяется в медицинской генетике. Реальным объектом исследования при массовом скининге могут быть только биологические жидкости. В практике массового скрининга на наследственные дефекты обмена используется только кровь (пуповинная, капиллярная и венозная): цельная нативная, цельная, высушенная на фильтровальной бумаге,

атакже сыворотка. Единственным исключением из этого правила является использование пятен мекония, высушенного на фильтровальной бумаге, в программах массового скрининга на кистофиброз поджелудочной железы. Полоски фильтровальной бумаги с образцом материалов отправляют по почте в диагностические центры, где опытные специалисты проводят соответствующую диагностику.

Контингенты для проведения программ массового скрининга различаются в зависимости от искомого дефекта, по возрасту, национальной или рассовой принадлежности. Просеивание на наследственные аминоацинурин (фенилкетонурия,ФКУ) необходимо проводить в первые дни и недели жизни,

ана врожденный гипотиреоз – даже в первые часы жизни, чтобы терапия оказалась эффективной. Скрининг на аномальные гемоглобины целесообразен в популяциях, подвергавшихся действию такого фактора, как малярийный плазмодий, обитающий в районе Средиземноморья, тропической Африки, Юго-Восточной Азии.

Цели массового скрининга:

доклиническое выявление заболеваний, когда ранее лечение дает хороший эффект;

выявление лиц с риском передачи наследственного заболевания;

популяционные исследования по определению частоты, течения и спектра заболевания, когда выявление само по себе не приносит прямой пользы для пораженного индивида.

Общие требования для массовых просеивающих программ:

заболевание, по которому проводится массовый скрининг, должно быть достаточно распространенным (встречаться с частотой не менее 1 на 50000- 1 на 200000) и приводить без своевременного выявления и лечения к серьезному снижению жизне- и трудоспособности;

метод должен быть надежным, т.е. при 2-кратной проверке разными исполнителями давать один и тот же результат;

метод должен быть диагностически значимым, чувствительным и специфичным;

не должно быть ложноотрицательных результатов тестирования;

должны существовать адекватные меры профилактики (лечение, пренатальная диагностика).

Впрактике мирового здравоохранения используются следующие виды просеивающих программ среди новорожденных: на аминоацидопатии фенилкетонурию, галактоземию, гипотиреоз, муковисцидоз, недостаточность

а1-антитрипсина, адреногенитальный синдром (сольтеряющая форма). Приведем пример массовой просеивающей программы в нашей стране –

массовый скринг на ФКУ. ФКУ относится к избыточным аминоацидопатиям

– ферментопатиям, характеризующимся избыточным накоплением аминокислот в биологических жидкостях и клетках. Среди новорожденных частота ФКУ составляет 1:6000- 1:15000). Объектом исследования является кровь, забор которой производится, как правило, на 5-6-й день жизни (обычно в день выписки из родильного дома) и пятки новорожденного. К этому времени вследствие кормления ребенка грудным молоком в крови накапливается достаточное для диагностики количество фенилаланина, что позволяет избежать ложно отрицательных результатов. Полоску фильтровальной бумаги, пропитанную капиллярной кровью посылают по почте в региональные медико-генетические центры или в медикогенетические консультации, где производят анализ. В программах массового просеивания на ФКУ и другие аминоацидопатии используют 3 метода: микробиологический, хроматографический и флюорометрический.

Вначале 60-х годов в США в практику здравоохранения был введен микробиологический ингибиторный тест Гатри. На поверхность прозрачной агаровой среды помещают диски фильтровальной бумаги, равномерно пропитанные капиллярной кровью обследуемых, и контрольный ряд дисков, пропитанных кровью с точно известными концентрациями искомой аминокислоты. Рост микробов появляется только вокруг дисков, содержащих избыточные концентрации аминокислот. Сравнивая диаметр зоны роста вокруг опытного и контрольных дисков, можно определить концентрацию избыточной аминокислоты. Метод Гатри прост и дешев; для его проведения достаточно 2 мл крови. Его легко автоматизировать, благодаря чему одновременно можно выявлять и другие наследственные аминоацидопатии.

Хроматографические методы основаны на различном распределении аминокислот из биологических жидкостей между неподвижной и подвижной фазами. В программах массового просеивания используют методы распределительной хроматографии на бумаге и в тонком слое (на пластинках с тонким слоем силикагеля или целлюлозы промышленного производства). Преимуществом хроматографических методов является одновременная оценка всего спектра аминокислот в тестируемой биологической жидкости. Недостаток этих методов заключается в сложности интерпретации результатов при отстутствии предварительной обработки образца или в высокой трудоемкости при обработке. Тонкослойная хроматография по

сравнению с бумажной является более быстрым и четким методом, но она на много дороже и требует обязательной предварительной обработки образца.

Принцип флюорометрического метода определения фенилаланина состоит в том, что 1-фенилаланин в присутствии 1-лейцил-1-аланина образует с нингидрином флюоресцирующее соединение, концентрацию которого можно измерить с большой точностью на спектрофлюориметре. Таким же методом может быть определена концентрация тирозина и гистидина. Метод легко автоматизируется. Недостатки этого метода заключаются в использовании дорогостоящей аппаратуры и необходимости исследовать неактивную плазму или элюат аминокислот из высушенных пятен крови, а также в низкой пропускной способности (только около 20 анализов в день). Несомненное достоинство метода - высокая точность измерений.

На всей территории нашей страны с 1985 г. в отличие от полуколичественных тестов Гатри введено массовое просеивание на ФКУ и хроматографического метода признано целесообразным использование определения фениланина с высокой точностью на автоматических флюориметрах – флюоросканах с высокой пропускной способностью.

В качестве первого в историческом плане скринирующего метода выявления ФКУ стоит отметить пробу Фелинга с треххлористым железом. Объект исследования – моча. Проба специфична для выявления кетоновых тел (положительная проба с треххлорным железом отмечается и при других аминоацидопатиях – лейциноз, тирозиноз, гистидинемия), но не показательна

впериоде новорожденности, так как уровень метаболитов фенилаланина в моче «отстает» от степени гиперфенилаланинемии, что ведет к гиподиагностике этого тяжелого заболевания. К недостаткам этой качественной пробы можно отнести ее низкую информативность и трудности

винтерпретации результатов. Однако в свое время именно эта простая и общедоступная проба доказала высокую эффективность использования скринирующих программ при выявлении больных с нарушениями обмена веществ.

Наряду с массовым существует и селективный (выборочный) скрининг.

Контингенты этих программ – группы лиц, среди которых ожидается накопление тех или иных наследственных дефектов обмена. К ним относятся умственно остальные больные домов инвалидов, спецшкол; лица с хроническими заболеваниями, находящиеся в нефрологических, пульмонологических, гематологических, ортопедических, гастроэнтерологических, офтальмологических отделениях клиник и специализированных учреждений. Подозрение на наследственные болезни обмена веществ вызывают следующие симптомы: несоответствие роста и массы тела возрастным нормам, отставание в психомоторном развитии, нарушение речевого развития, «необычное» лицо, трудности с вскармливанием, диарея, желтуха, гепато- и спленомегалия, гингивиты, нарушение пигментации, кожная сыпь, нарушение ороговения эпидермиса, мышечная гипотония, нарушение походки, атаксия, двигательная расторможенность, дефекты пове-дения, умственная отсталость, образование

камней в почках, изменения костной системы, склонность к тромбообразованию, прогрессирующее снижение слуха и зрения, судороги, необычный запах мочи и пота и др.

Биохимический селективный скрининг проводят в медико-генетических консультациях в следующем объеме: качественные реакции с мочой, хроматография аминокислот и углеводов мочи, хроматография аминокислот крови. Биохимический анализ, проводимый на клетках, позволил перейти от анализа метаболитов к исследованию непосредственно ферментов и структурных белков, в том числе клеточных рецепторов – к ферментодиагностике.

М о л е к у л я р н о - г е н е т и ч е с к и е м е т о д ы

В настоящее время используются методы для выделения и характеристики гена без предшествовавшего знания о его функциях и белковом субстрате. Первым этапом является картирование гена с помощью анализа сцепления генов и выявления цитогенетических микроаномалий. Последующие этапы состоят в идентификации неизвестных ДНКсегментов и клонировании генов, которые располагаются все ближе и ближе к искомому гену. Для полного описания структуры и организации генов, в частности последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК, служат методы молекулярной генетики, позволяющие составлять подробные генетические карты хромосом.

Для экспериментального определения последовательности нуклеидов необходимо достаточное количество одинаковых по размерам и по нуклеотидным последовательностям молекул ДНК. Эту проблему решает, в частности, метод рекомбинантных ДНК называют молекулы ДНК, полученные вне живой клетки (в пробирке) вследствие встраивания природной или чужеродной ДНК в вектор – бактериальную плазмиду или геном вируса. Общим для всех методов молекулярной генетики является использование рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз) – ферментов, которые «узнают» спицифические последовательности в двойной спирали ДНК и разрезают ее на многочисленные фрагменты. Кроме «узнавания» определенных участков вдоль ДНК (благодаря их специфической последовательности), многие рестриктазы разрезают двойную спираль так, что место разреза одной цепи сдвинуто относительно второй. В результате образуются «липкие концы», способные соединятся с неродственными, но комп-лементарными ДНК-молекулами под воздействием ДНК-лигаз. Если один из двух фрагментов такой молекулы ДНК представляет собой, например, плазмиду, то и вся молекула при попадании в бактериальную клетку-хозяина также может реплицироваться. Процесс, посредством которого одна молекула ДНК присоединяется к другой, способной реплицироваться автономно, называется молекулярным клонированием. Метод, основанный на этом процессе, позволяет в больших количествах получать фрагменты чужеродной ДНК (клоны).

Определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК –

секвенирование.

Исходный набор фрагментов ДНК, полученных с помощью рестриктаз, метят радионуклидом и производят разделение их электрофорезом, что позволяет считывать данные прямо с рентгеновской пленки.

Метод полимеразной цепной реакции (ферментативная амплификация)

позволяет получить многократное (до 107) умножение какого-либо фрагмента ДНК для дальнейшей работы с ним.

Достижения молекулярной генетики и методы исследования ДНК быстро нашли применение для решения практических задач медицинской генетики. Основной областью использования молекулярно-генетических методов являются диагностика гетерозиготного носительства, доклиническая диагностика и перинатальная диагностика.

Опубликованы результаты молекулярно-генетических исследований, проведенных при известных синдромах, для которых характерны микроделеции или микродупликации: Лангера-Гидиона, Прадера-Вилли, Бекуита-Видемана, аниридия (опухоль Вильмса) и др. Поскольку наиболее существенные успехи достигнуты в изучении глобиновых генов, полученные данные применяют для диагностики гемоглобинопатий. При этом использовалось несколько подходов. Было обнаружено, что фенотипически не проявляющиеся наследуемые различия в последовательности основании ДНК используют при генеалогических исследованиях в качестве генетических маркеров. С их помощью можно установить наличие тесно сцепленных с ними генов, вызывающий моногенные заболевания.

Принципы ДНК-диагностики состоят в следующем. Первая процедура (блоттинг) – с помощью рестриктаз молекулу ДНК разрезают на многочисленные фрагменты, каждый из которых может содержать искомый патологический ген. На втором этапе этот ген выявляют с помощью специальных «зондов» ДНК – синтезированный последовательностей нуклеотидов, меченных радионуклидом.

Б л и з н е ц о в ы й м е т о д Близнецовый анализ – метод медицинской генетики, позволяющий

оценить соотносительную роль наследственности и среды в развитии разнообразных признаков, в том числе болезней человека. Близнецовый метод может оказать эффективную помощь в решении важнейших задач медицины: индивидуализации медикаментозной терапии, изучении этиологии и патогенеза различных заболеваний, исследовании личностных характеристик больных, влияющих на эффективность лекарственной терапии и профилактических мероприятий.

Многоплодием у человека называется одновременное развитие в матке женщины двух и более плодов. Рождение близнецов составляет примерно 1,5- 2,5% от общего числа родов, тройни рождаются в среднем один раз на 10-15 тыс. родов, большее число плодов – очень редкое явление.