vse_metody_MIKROB

незавершенный – при котором микробы не погибают, а размножаются в фагоцитах (при туберкулезе, гонорее, менингококковой инфекции др.).

7. Комплемент как защитная система организма, пути его активации.

Комплемент (complement (лат.) – дополнение) – комплекс сывороточных белков, которые последовательно активируются и вызывают лизис бактерий (бактериолиз) и других чужеродных клеток (цитолиз).

Функции комплемента: лизис бактерий и других чужеродных клеток, усиление фагоцитоза, участие в аллергических реакциях немедленного типа.

Комплемент (С) состоит из 9 белковых компонентов (фракций) – от С1 до С9. Кроме того, первый компонент (С1) состоит из трѐх подфракций.

Все компоненты комплемента можно условно разделить на три блока:

I блок – распознающий (С1 с подфракциями); II блок – активирующий (С2 – С4);

III блок – мембраноатакующий (С5 – С9).

При появлении в организме микробов или их продуктов запускается активация комплемента по типу каскадной реакции.

Процесс активации и самосборки системы комплемента может запускаться тремя путями, получившими названия классический, лектиновый и альтернативный (рис.1) и всегда заканчивается образованием мембраноатакующего комплекса.

Классический путь активации комплемента. В нем участвуют все ком-

поненты комплемента. Инициатором активации классического пути является иммунный комплекс «антиген + антитело». Мембраноатакующий блок образует в мембране клетки-мишени многочисленные поры. Это приводит к выходу содержимого клетки и ее гибели.

Лектиновый путь активации комплемента запускается поверхностными полисахаридами бактерий и грибов, содержащими маннозу. Манноза распознается циркулирующим в крови белком, который называется маннозосвязывающий лектин. Этот белок активирует С4-С2 фракции комплемента. Далее активация совпадает с классическим путем.

Альтернативный путь активации комплемента в отличие от классиче-

ского пути активируется не иммунным комплексом, а отдельными компонентами микробных клеток. В нем не участвуют фракции С1, С4 и С2. Их функции выполняют сывороточные белки: факторы В, D и пропердин (Р). Каскадная цепная реакция при альтернативном пути начинается с взаимодействия микробного антигена (например, липополисахарида) с факторами В, D и Р, с последующей активацией компонента С3. В дальнейшем все этапы активации комплемента осуществляются в той же последовательности, как при классическом пути.

На ранних этапах инфекции, когда нет еще комплексов Аг+Ат , лизис бактерий осуществляется при активации комплемента лектиновым и альтернатив-

10

ным путѐм. По мере накопления антител и образования иммунных комплексов большее значение приобретает классический путь активации.

С5 С6 С7

С8 С9 бактериолиз, цитолиз

Рисунок 1 – Пути активации комплемента

Практическая работа.

1.Способы выявления ферментов инвазии (плазмокоагулаза, лецитиназа, ДНК-аза) у стафилококков (демонстрация).

2.Определение наличия гемолизинов (экзотоксинов) у стафилококков (демонстрация).

11

Занятие № 10

Тема. Антигены. Антитела. Серологические реакции.

Цель занятия. Изучить характеристику антигенов и антител. Изучить поста-

новку и учет простых (реакция агглютинации, реакция преципитации) и слож-

ных (реакция нейтрализации, реакция непрямой гемагглютинации) двухкомпо-

нентных серологических реакций. Изучить постановку и учет трехкомпонент-

ных серологических реакций (реакция связывания комплемента, реакция имму-

нофлюоресценции, иммуноферментный анализ).

I. Теоретические знания:

1. Антигены, их признаки, классификация.

2. Антитела (иммуноглобулины).

3. Серологические реакции. Классификация серологических реакций.

II.Практические навыки:

1.Постановка и учет реакции агглютинации на предметном стекле.

2.Учет реакции преципитации в геле для определения токсигенности дифте-

рийной культуры.

3.Учет реакции связывания комплемента.

1

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ЗАНЯТИЮ

1. Антигены, их признаки, классификация.

Антигены – это генетически чужеродные вещества, которые вызывают в организме иммунный ответ, направленный на их устранение: образование антител и активацию лимфоцитов. Антигены способны специфически взаимодействовать с антителами и активированными лимфоцитами.

Антиген состоит из 2 частей: высокомолекулярного носителя – шлеппера (schlepper (англ.) – тягач) и низкомолекулярных антигенных детерминант (эпитопов). Носитель чаще является белком, а детерминантами могут быть простые химические группировки (кислотные радикалы, дипептиды и др.).

Признаки антигенов:

1.Иммуногенность – потенциальная способность антигена вызывать иммунный ответ в организме.

Иммуногенность определяется:

-степенью чужеродности антигена по отношению к макроорганизму;

-молекулярной массой и химической природой носителя (шлеппера). Наиболее выраженной иммуногенностью обладают белки.

2.Антигенность – способность антигена специфически активировать компоненты иммунной системы (антитела, Т-лимфоциты) и специфически взаимодействовать с ними.

3. Специфичность – определяется только эпитопами антигена. Один антиген может иметь несколько эпитопов.

Классификация антигенов по иммунологической активности:

полноценные антигены обладают иммуногенностью и антигенностью. По химической природе это белки или комплексы белков с липидами, полисахаридами, нуклеиновыми кислотами.

неполноценные антигены (гаптены) не обладают иммуногенностью и самостоятельно не вызывают иммунного ответа, но могут взаимодействовать с антителами или активированными лимфоцитами. При соединении с каким-либо белком, присутствующим в организме, гаптены становятся полноценными антигенами и вызывают иммунный ответ в организме. Причем, антитела, образовавшиеся к комплексу «белок + гаптен», реагируют не только с этим полноценным антигеном, но и со свободным гаптеном, не соединенным с белком. Примеры гаптенов: липиды, нуклеиновые кислоты, антибиотики и др.

Антигенная структура бактерий и еѐ диагностическое значение.

О-антиген – соматический, связан с клеточной стенкой. Его основу составляет липополисахарид, термостабильный. У грамотрицательных бактерий О-антиген является эндотоксином.

2

Н-антиген – жгутиковый, по химической природе белок, термолабильный.

К-антигены – капсульные (у капсульных бактерий) и оболочечные (у грамотрицательных бактерий). Эти антигены располагаются на поверхности клеточной стенки. По химической природе чаще полисахариды, реже полипептиды с разной степенью термостабильности.

Экзотоксин – белок.

Диагностическое значение антигенной структуры бактерий: для идентификации возбудителей по антигенным свойствам в серологических реакциях.

Антигены бактерий по функциональному значению:

1.Протективные антигены – первыми распознаются иммунной системой, т.к. обладают высокой иммуногенностью. Благодаря этому развивается полноценный иммунный ответ, защищающий организм от микроба в целом. Они различаются по химической природе и локализации в микробной клетке. Благодаря обнаружению и изучению протективных антигенов у патогенных микроорганизмов создаются высокоэффективные вакцины, содержащие эти антигены и формирующие прочный искусственный иммунитет.

2.Перекрестно реагирующие антигены – имеют общие эпитопы для кле-

ток микроорганизма и тканей макроорганизма. Возбудитель дизентерии имеет перекрестные антигены с тканью кишечника, стрептококки – с тканью сердечной мышцы, почек и др. На эти антигены не вырабатываются антитела, не формируется иммунитет, поэтому они являются факторами патогенности возбудителей инфекционных заболеваний.

Положительная роль перекрестно реагирующих антигенов проявляется в возможности формирования симбионтной микробиоты организма человека из непатогенных и условно-патогенных микробов, которые имеют эти антигены.

1.Антитела (иммуноглобулины).

Антитела (Ig) – высокоспециализированные белки, которые вырабатываются в ответ на появление антигена в организме и взаимодействуют с этим антигеном, образуя иммунный комплекс.

Иммуноглобулины вырабатываются плазматическими клетками и циркулируют в крови и других биологических жидкостях организма.

Основная функция молекул Ig – специфическое распознавание чужеродных антигенов и связывание с ними. Это приводит к удалению микробов и/или их токсинов из организма. Некоторые антитела специфически метят антигены и делают их более доступными для уничтожения фагоцитами. Эта функция называется «опсонизация» – усиление фагоцитоза.

Существует 5 классов иммуноглобулинов: IgМ, IgG, IgА, IgЕ, IgD. Основной структурной единицей всех классов иммуноглобулинов является IgG.

Структура и свойства молекулы IgG (рис. 2).

3

Молекула иммуноглобулина G состоит из двух идентичных лѐгких (L) и двух тяжѐлых (H) полипептидных цепей, различающихся по длине и молекулярной массе. Тяжелые и легкие цепи связаны между собой попарно дисульфидными (S-S) связями.

Каждая из цепей имеет вариабельные и константные участки. Легкая цепь имеет один вариабельный участок (VL) и один константный участок (CL).

Тяжелая цепь имеет один вариабельный участок (VH) и три константных участка (CH1, CH2, CH3). Константные участки CH2 и CH3 формируют Fcфрагмент. Этот фрагмент связывает комплемент, фиксирует молекулу иммуноглобулина на мембранах клеток и обеспечивает проникновение IgG через плаценту.

Вариабельные участки легких и тяжелых цепей формируют два активных центра, вступающих во взаимодействие с эпитопами антигена.

В месте перегибов тяжѐлых цепей находятся шарнирные участки, что придаѐт молекуле иммуноглобулина гибкость при взаимодействии с антигеном.

АКТИВНЫЕ ЦЕНТРЫ

ШАРНИРНЫЙ

УЧАСТОК

Fc-фрагмент

Условные обозначения: L – лѐгкая цепь; Н – тяжѐлая цепь; VL, и VH – вариабельные участки, СL, CH, CH2, CH3 – константные участки. Утолщѐнные линии Н-цепей соответствуют шарнирному участку; Fc – константный фрагмент.

Рисунок 2 – Схематическое изображение молекулы lgG.

4

Свойства антител:

-гетерогенность (многообразие);

-специфичность – способность реагировать с конкретным антигеном;

-аффинность – сила связи одного из активных центров Ig с одним эпитопом антигена;

-авидность (жадность) – показывает, какое количество антигенов может связать молекула антитела. Авидность зависит от количества активных центров, взаимодействующих с антигенным эпитопом.

Классификация, функциональное и диагностическое значение отдельных классов иммуноглобулинов.

IgM (тяжѐлые): состоят из 5 молекул иммуноглобулина G; филогенетически самый древний класс иммуноглобулинов. Первыми синтезируются в организме плода. Появляются в сыворотке крови больного в начале инфекционного заболевания, что указывает на острое течение. Не проходят через плаценту. Содержание в сыворотке крови 5-10% от общего количества иммуноглобулинов. Обладают в основном антибактериальным действием, хорошо фиксируют своим Fc-фрагментом комплемент с последующей его активацией. Обладают самой высокой авидностью. Мономеры IgM находятся на поверхности В- лимфоцитов в виде мембранного Ig и образуют В-клеточный рецептор (BCR) (см. занятие №11).

IgG (лѐгкие): проходят от матери к плоду через плаценту, что определяет защиту новорожденного от инфекции. Образуются в организме в разгар острого заболевания. При реинфекции и рецидиве IgG образуются в начале заболевания. Являются универсальными, т.к. обладают антибактериальным, антивирусным, антитоксическим действием. Содержание в сыворотке крови – около 80% от общего количества Ig.

IgА бывают 2-х видов: сывороточные и секреторные.

Сывороточные IgА представлены мономерами IgG. Содержание их в сыворотки крови 10-15%. Через плаценту не проходят.

Секреторные IgA (SIgA) присутствуют на слизистых оболочках дыхательных путей, кишечника, мочеполовых органов, а также в слюне и грудном молоке. Встречаются чаще в виде димеров IgG. Для защиты от действия протеолитических ферментов имеют особую структуру – секреторный компонент (Sc). SIgA – это основной фактор местного иммунитета слизистых оболочек организма, т.к. предотвращает прикрепление микробов к слизистым оболочкам.

IgE (реагины): мономеры IgG, не проходят через плаценту, содержание в сыворотке крови 0,01-0,02%. Обладают цитофильностью – соединяются Fc– фрагментом с тучными клетками и базофилами. Играют важную роль в развитии аллергических реакций немедленного типа. Обладают антигельминтозной активностью.

IgD: мономеры IgG, не проходят через плаценту. Составляют 0,1% от общего количества иммуноглобулинов. Находятся на поверхности В-лимфоцита, контролируя его активацию.

5

По направленности действия различают следующие антитела:

-противогрибковые;

2.Серологические реакции. Классификация серологических реакций (табл.2).

Основой серологических (serum (лат.) – сыворотка крови, logos (лат.) – учение) реакций являются особенности взаимодействия антител с антигеном в присутствии физиологического раствора (0,85% NaCl).

Назначение серологических реакций:

проведение серологического метода диагностики – определение в сыворотке крови больного антител к конкретному возбудителю инфекционного заболевания с помощью известного антигена. Результаты такой диагностики выражаются в виде концентрации антител – титра реакции. Титром серологической реакции называется наибольшее разведение сыворотки, при котором наблюдается положительный результат;

идентификация возбудителя с помощью известных антител – иммунных диагностических сывороток.

Все диагностические реакции характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью.

Таблица 2 – Классификация серологических реакций

Примечание: Простые 2- и 3-компонентные реакции – это реакции, для реализации и визуального учета которых достаточно 2 или 3 иммунологических компонентов. Сложные 2- и 3-компонентные реакции – это реакции, для реализации которых достаточно 2 или 3 иммунологических компонентов, а для визуального учѐта необходима индикаторная система.

Реакция агглютинации («agglutinatiо» (лат.) – склеивание): 2-

компонентная простая серологическая реакция (рис. 3). Компоненты реакции

6

агглютинации (РА): корпускулярный антиген (бактериальные клетки) и антитела. В результате реакции образуется агглютинат (комплекс [Аг+Ат]).

Антитела «склеивают» бактерии и препятствуют их размножению.

Рисунок 3 – Схема РА с IgM-антителами (а) и IgG-антителами (б)

РА используется:

1.Для идентификации микробов (определение вида возбудителя, выделенного от больного) с помощью известных антител (диагностическая сыворотка). Этот вариант реакции агглютинации выполняется в 2-х технических модификациях: ориентировочная (на предметном стекле); развернутая (в пробирках) – для окончательной идентификации исследуемой культуры. Используется для диагностики брюшного тифа, дизентерии, холеры и др. заболеваний.

2.Для определения титра антител в сыворотке крови обследуемого с помощью известных антигенов (диагностикумы). Технически всегда выполняется в виде развернутой РА. Используется для диагностики брюшного тифа, бруцеллеза и др. заболеваний.

Чтобы подтвердить клинический диагноз, титр антител, обнаруженных в сыворотке больного, сравнивают с диагностическим титром для данного заболевания.

Диагностический титр – это минимальное содержание антител в сыворотке крови больного, позволяющее установить диагноз инфекционного заболевания. Например, при брюшном тифе и бруцеллѐзе диагностический титр РА для взрослых – 1/200, для детей – 1/100.

Если титр реакции совпадает с диагностическим титром, значит, пациент болен.

7