Praktikum_po_fiziologii_rastenij

Метод отпечатков

Лист растения накладывают на однородную бумагу и обводят контур остро отточенным карандашом. Получив отпечаток листа, определяют его площадь весовым методом.

Для этого вырезают бумагу по контору листовой пластинки и взвешивают на торзионных или аналитических весах. Одновременно из такой же бумаги вырезают квадрат, например площадью 100 см2 (10×10 см), и также определяют его массу. Площадь исследуемого листа находят по формуле

S=aC/b,

где а – масса контура листа, мг; b – масса квадрата бумаги, мг; C – площадь квадрата бумаги, см2.

Описанный метод прост и достаточно точен, но малопроизводителен. Кроме того, его практически нельзя использовать при исследовании гофрированных и сложных листьев.

Метод высечек

Этот наиболее доступный и продуктивный метод особенно ценен в полевых условиях. Суть его в следующем. Отбирают среднюю пробу растений, быстро срезают листья и определяют их массу. Затем из каждого листа выбирают пробочным сверлом определенного диаметра несколько высечек, объединяют их вместе и устанавливают массу. Диаметр сверла выбирают в зависимости от размеров листовой пластинки и ее поверхностной плотности. Площадь листьев определяют по формуле

S=ac/b,

где а – общая масса сырых листьев, г; b – общая масса сырых высечек, г; c – общая площадь высечек, см2.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Что представляют собой фотосинтетические пигменты по химической природе?

2.Чем отличается хлорофилл а от хлорофилла b?

3.Какими химическими и физическими свойствами обладают хлорофиллы?

4.Какие спектры поглощения имеют фотосинтетические пигменты?

5.Что такое флуоресценция? Что она доказывает?

6.Почему на свету изолированные хлоропласты способны осуществлять реакцию, в которой кислород выделяется, но СО2 не восстанавливается?

7.Что такое чистая продуктивность фотосинтеза?

51

ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ

Все жизненные процессы, протекающие в растительном организме, связаны с затратой энергии. Рост, питание, размножение, обмен веществ, процессы синтеза и распада органических веществ, прорастание, передвижение и поглощение веществ и т.д. связаны с затратой энергии. Это обусловлено тем, что живая клетка представляет собой открытую энергетическую систему и жизненные процессы в ней протекают только при условии притока энергии извне. Для поддержания жизненных процессов у растений имеется 2 источника энергии: солнечная энергия, усваиваемая и запасаемая в процессе фотосинтетического фосфорилирования в АТФ. А также запасаемая в образуемых органических веществах в процессе фотосинтеза, в основном в углеводах, энергия которых используется растением в процессе их окисления, т.е. в процессе дыхания, при котором в митохондриях также она запасается в АТФ. Поэтому дыхание является процессом противоположным фотосинтезу и выражается следующим суммарным уравнением:

С6Н12О6 + 6О2 →6СО2 + 6Н2О + 682 к.кал (2824 кДж).

Дыхание – сложный многоступенчатый процесс биохимического преобразования органического вещества с выделением энергии для процессов жизнедеятельности. В процессе дыхания образуется также целый ряд промежуточных веществ, идущих на синтез белков, жиров и других веществ. Таким образом, процессы обмена веществ и энергии, происходящих в клетке, неразрывно связаны с дыханием. Дыхание протекает, в основном, в митохондриях, при котором дыхательный субстрат окисляется не кислородом, а отнятием водорода (дегидрированием) с участием ферментов дегидраз и уже окислением водорода до воды с участием цитохромной системы, фермента цитохромоксидазы и кислорода воздуха по схеме

где RH2 – дыхательный субстрат; Д – дегидразы.

Часть образующихся в процессе дыхания восстановленных коферментов НАД могут использоваться на восстановление нитратов до аммиака, восстановительное аминирование кетокислот и т.д.

52

Работа 28. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВУ ВЫДЕЛЕНИЯ СО2

Общие сведения. Наиболее общим показателем скорости окисления является интенсивность дыхания (ИД), о котором можно судить по поглощению кислорода, количественному выделению углекислого газа и окисленного органического вещества. Интенсивность дыхания и его энергетическая эффективность зависит от физиологического состояния растений, внешних условий. В свою очередь, интенсивность дыхания может, в известной мере, быть показателем уровня физиологической активности тканей исследуемого растения.

Материалы и оборудование. Растительный материал различных частей растений или их физиологического состояния (проросшие и непроросшие семена, молодые и старые листья, листья и побеги, распускающиеся почки и побеги, цветки и листья и т.д.), 0,1 н. раствор барита, 0,1 н. раствор соляной или щавелевой кислоты, 1% раствор фенолфталеина. Весы, конические колбы на 250 мл с резиновыми пробками, и резиновые пробки с отверстием для титрования, нитки, марлевые мешочки или марлевые салфетки 15×15 см, бюретки для титрования, стеклянные воронки.

Порядок выполнения работы. Метод заключается в учете количества СО2, выделяемого органами растения при дыхании и поглощении его баритом. Процесс поглощения диоксида углерода баритом можно записать в виде уравнения:

Ва(ОН)2 + СО2 → ВаСО3 + Н2О.

Для этого в конические колбы на 250 мл с подогнанными резиновыми пробками по количеству изучаемых объектов быстро залить из колбы сифоном с зажимом по 10 мл 0,1 н. раствора Ва(ОН)2 и внести по 2 капли фенолфталеина, сразу закрыть плотно резиновыми пробками. Отвесить по 5- 10 г исследуемого материала: молодые и старые листья, распускающиеся почки и побеги, проросшие и не проросшие семена, цветки и листья и др., поместить их в маршевые мешочки или марлевые салфетки 15×15 см, завязав их ниткой, оставив длинный конец. Подвесить мешочки в колбы так, чтобы они не касались раствора барита, закрепив их за конец нитки, прижав к стенке колбы пробкой. Записать время для каждой колбы, когда они были закрыты пробкой. При использовании корковых пробок, необходимо заливать их парафином. Аналогично подготовить и контрольную колбу, в которую тоже налить 10 мл барита и 2 капли фенолфталеина, закрыть плотно пробкой. Колбы с объектами, содержащими хлорофилл, необходимо на все время опыта поместить в темноту для исключения процесса фотосинтеза. Время от времени колбы следует осторожно покачивать, чтобы разрушать пленку ВаСО3, препятствующую полноте поглощения СО2, не допуская попадания ни

53

одной капли раствора на мешочек с материалом. Через 30 минут вынуть материал, быстро закрыть колбу пробкой и отметить время окончания опыта. Провести титрование оставшейся щелочи, приливая из бюретки каплями через отверстие в пробке 0,1 н. щавелевую или соляную кислоту до исчезновения розового окрашивания. Чтобы избежать уменьшения концентрации раствора барита из-за поглощения углекислоты из воздуха, следует провести титрование колб, используя для титрования пробку с отверстием. Контрольную колбу можно титровать через 20 минут после наливания раствора барита.

Результаты опыта записывают в таблицу 17 по приведенной форме.

17. Интенсивность дыхания

Интенсивность дыхания определяется количеством выделенного мг СО2 на г растительной массы за час, по формуле:

где а – количество 0,1 н соляной или щавелевой кислоты, израсходованной на титрование барита в контрольной колбе; b – результат титрования опытной колбы; К – поправка к титру соляной или щавелевой кислоты; 2,2 – количество мг СО2, эквивалентное 1 мл 0,1н соляной или щавелевой кислоты; р – масса растительного материла, г; t – продолжительность опыта в минутах; 60 – для перевода времени на час.

Сделать выводы об интенсивности дыхания различных органов растения в зависимости от их физиологического состояния.

54

Работ 29. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОГО КОЭФФИЦИЕНТА ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЯН

Общие сведения. Дыхательный коэффициент (ДК) – это объемное или молярное отношение СО2, выделенного при дыхании, к поглощенному за это время О2 (СО2/О2). ДК служит характеристикой калорийности субстрата, т.е. его энергоемкости. Степень энергоемкости зависит от вида дыхательного субстрата и степени его окисленности. При дыхании могут использоваться жиры, белки, углеводы и органические кислоты. Чем больше окислен материал, тем меньше поглощается кислорода воздуха, а значит и меньше выделяется энергии. Поэтому, при нормальном доступе кислорода величина ДК зависит от субстрата дыхания. Если в процессе дыхания используется углеводы, то ДК равен единице. Это видно из уравнения С6Н12О6 + 6О2 → 6Н2О + 6СО2, в котором отношение 6СО2/6О2 равно 1. При окислении жирных кислот и белков ДК будет меньше единицы. Они менее насыщены кислородом, и на их окисление идет больше О2. Например, окисление масляной кислоты СН3-СН2-СН2-СООН + 5О2 → 4Н2О + 4СО2, имеет отношение 4СО2/5О2 равное 0,8, т.е. меньше единицы.

При использовании более окисленных органических кислот, например щавелевоуксусной кислоты, ДК больше единицы: С4Н4О5 + 2,5О2→2Н2О + 4СО2, соотношение 4СО2/2,5О2 равно 1,6. Поэтому, как более калорийный субстрат для дыхания, в качестве запасного вещества жиры составляют более 80% видов растений. Жиры обладают и другими преимуществами: низкий удельный вес, не гигроскопичность.

Материалы и оборудование. Наклюнувшиеся семена (подсолнечника, клещевины, гороха, пшеницы), 20-ный% раствор КОН, окрашенная вода в химическом стаканчике. Прибор, состоящий из пробирки с хорошо притертой резиновой пробкой, в которую вставлена изогнутая под прямым углом тонкая стеклянная трубка; горизонтальное колено трубки градуируют, прикрепляя к ней при помощи резиновых колечек полоску миллиметровой бумаги. Штатив для пробирок, фильтровальная бумага, фарфоровые чашки, пинцеты, пипетки, секундомер или песочные часы.

Порядок выполнения работы. Помещают в пробирку (примерно до половины) наклюнувшиеся семена (подсолнечника, клещевины, гороха, пшеницы) закрывают ее пробкой, в которую вставлена изогнутая градуированная трубка.

55

которое соответствует разности между объемами поглощенного кислорода и выделенной углекислоты.

Открывают пробку с семенами и вкладывают в нее пинцетом свернутую в кольцо полоску фильтровальной бумаги, смоченную 20%-ным раствором едкого натра. Закрывают пробирку пробкой с трубкой с каплей окрашенной жидкости. Отмечают положение мениска при пятиминутных интервалах и вычисляют среднюю величину (В). Обозначают объем поглощенного кислорода через В, т.к. весь выделяемый диоксид поглощается щелочью, а объем выделенной углекислоты определяют через А, как разницу между поглощенным О2 и выделенным СО2. Зная величины А и В, находят дыхательный коэффициент:

А = О2 – СО2; В = О2; СО2 = В – А Отсюда дыхательный коэффициент

56

Делают вывод о зависимости величины дыхательного коэффициента от характера окисляемых веществ.

Производят теоретический расчет дыхательного коэффициента при окислении до СО2 и Н2О какого-либо жира, например, триолеина, имеющего формулу С57Н104О6.

ФЕРМЕНТЫ ДЫХАНИЯ

Дыхание – это сложный окислительно-восстановительный процесс, который осуществляется при участии комплексной системы ферментов. Ферменты, катализирующие непосредственно окислительновосстановительные превращения дыхательного субстрата, разделяются на ряд групп. Дегидрогеназы (дегидразы), ферменты катализирующие дегидрирование субстрата, т.е. отнятие водорода и электрона от субстрата дыхания. Они активируют водород субстрата. Другие способствуют его переходу на соответствующий акцептор с более высоким редокспотенциалом, например, кислород. Такие дегидрогеназы называют аэробными дегидразами или оксидазами, т.к. они выполняют оксидазные функции, переводя протон водорода и электрон на кислород. Анаэробные дегидрогеназы переносят водород и электрон на промежуточные переносчики водорода.

По химической природе дегидрогеназы бывают пиридиновыми и флавиновыми. Это сложные ферменты, состоящие из апофермента (белковый носитель), определяющего их специфичность к определенному субстрату, и кофермента (небелковая часть), определяющим активность фермента. У пиридиновых коферментом служит НАД (никотинамидадениндинуклеотид) или НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат). В составе флавиновых дегидраз присутствует рибофлафин (витамин В2), который образует кофермент ФМН (флафинмононуклеотид) и ФАД (флавинадениндинуклеотид).

Оксидазы катализируют перенос электронов на кислород. Катализируемый ими процесс представляет конечный этап окисления – передачу электрона и протона на кислород воздуха, с образованием Н2О или перекиси водорода – Н2О2. Среди оксидаз большое место занимают ферменты, содержащие Fe (железопротеиды) и Сu (медьпротеиды). Железопротеиды: гемоглобин, каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза и цитохромы в цепи переноса электрона могут осуществлять различные реакции. К медьпротеидам относятся полифенолоксидазы или фенолоксидазы, а также аскорбиноксидаза. Полифенолоксидазы окисляют фенолы с образованием хинонов, в результате чего водород фенолов соединяется с кислородом, образуя Н2О. Познакомимся с работой некоторых дыхательных ферментов.

57

Работа 30. ОБНАРУЖЕНИЕ ДЕГИДРОГЕНАЗ В СЕМЕНАХ ГОРОХА (ФАСОЛИ)

Общие сведения. Растительные дегидрогеназы можно обнаружить с помощью некоторых химических соединений, например, метиленовая синь, имеющих в окисленном состоянии цветные молекулы. В восстановленном состоянии (т.е. присоединив водород) молекулы этих веществ становятся бесцветными. Эти соединения используются для обнаружения дегидраз.

Материалы и оборудование. Набухшие суточные семена фасоли (гороха), темно-синий водный раствор метиленовой сини. Нагретая водяная баня до 25-30 оС, пробирки, спиртовки, спички, резиновые пробки для пробирок.

Порядок выполнения работы. С семян набухшего гороха (фасоли) снимают кожуру. Часть семян убивают кипячением в течение 10 минут (на спиртовке в пробирке). Затем живые (опытные) и убитые (контрольные) семена помещают в две пронумерованные пробирки и в течение 5-10 минут окрашивают водным раствором метиленовой сини. Окрашенные семена промывают и заливают водой для создания анаэробных условий, так как дегидразы работают в анаэробных условиях. Пробирки закрывают пробками и ставят в термостат или на водяную баню при температуре 25-30 оС. Через некоторое время в опытной пробирке семена теряют синюю окраску. Последнее происходит потому, что дегидразы, участвующие в дыхании клеток, отняли и активизировали водород дыхательного материала (окисление дыхательного материала) и затем передали водород метиленовой сини, которая восстановилась и обесцветилась. В контрольной пробирке цвет семян остается синим, т.к. при кипячении семян дегидразы разрушились.

Описать результаты опыта и объяснить полученные результаты о работе дегидразы семян исследуемой культуры.

Работа 31. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ В РАСТИТЕЛЬНЫХ ТКАНЯХ

Общие сведения. Пероксидаза играет важную роль в окислительновосстановительных процессах, протекающих в растительном организме при дыхании и брожении, т.е. она является дыхательным ферментом. Она способна окислять органические соединения лишь с помощью каких либо органических перекисей. В растениях перекись водорода образуется под действием оксидаз (полифенолоксидаза, монофенолоксидаза). Пероксидаза вместе с перекисью водорода образует комплексные соединения, в результате чего перекись активируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода. Она может окислять полифенолы и некоторые органические амины. Например, под действием пероксидазы и перекиси водорода гидрохинон переходит в интенсивно буро окрашенный хинон.

58

ГИДРОХИНОН + Н2О2 → пероксидаза ХИНОН + Н2О

Материалы и оборудование. Клубни картофеля, 1%-ный раствор гидрохинона, 3%-ный раствор перекиси водорода, вода. Скальпели, пипетки, пластиковые тарелки.

Порядок выполнения работы. Из клубня картофеля поперек нарезают 4 пластинки толщиной 3-4 мм и раскладывают на пластиковой тарелке. На срез первой пластинки картофеля (носитель пероксидазы) наносят только воду, на 2-ю только гидрохинон, на 3-ю только Н2О2, на 4-ю перекись водорода и гидрохинон.

При окислении гидрохинона в хинон происходит интенсивное побурение среза. Слабое побурение среза наблюдается и без нанесения гидрохинона и перекиси водорода, оно не связано с действием пероксидазы, которая проявляет активность только в присутствии перекиси водорода, это происходит в связи с действием полифенолоксидазы, окисляющей полифенолы с участием молекулярного кислорода.

Результаты опыта записывают в таблицу 19 по приведенной форме.

19. Наличие пероксидазы в запасающих тканях картофеля

Объяснить особенности работы фермента пероксидазы, исходя из результатов опыта.

Работа 32. ОБНАРУЖЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ В ЛИСТЬЯХ ЭЛОДЕИ РАЗНОГО ВОЗРАСТА

Общие сведения. В процессе дыхания в качестве побочного продукта окисления веществ образуется перекись водорода, как активная форма кислорода (АФК), оказывающая в высоких концентрациях токсичное действие на цитоплазму. Обезвреживание перекиси происходит при участии ферментов каталазы, разлагающей ее на воду и молекулярный кислород по уравнению:

2H2O2 каталаза 2H2O O2 .

Существует ряд методов определения активности каталазы в растении. Наиболее наглядным и доступным демонстрационным, и в то же время,

59

дающим возможность определить изменение активности фермента, служит опыт наблюдения за активностью каталазы в листьях элодеи под микроскопом.

Материалы и оборудование. Веточка элодеи канадской (Elodea canadensis Michx.), 3%-ный раствор перекиси водорода. Предметные и покровные стекла, пинцеты, микроскоп.

Порядок выполнения работы. На предметное стекло наносят каплю 3%- ной перекиси водорода. В каплю помещают разрезанные пополам поперек старый и молодой лист срезами друг против друга на небольшом удалении, чтобы они вмещались в поле зрения микроскопа при малом увеличении, накрыть покровным стеклом и сразу рассматривают препараты под микроскопом.

Перекись водорода проникает в клетки листа элодеи и расщепляется в ней каталазой, что видно по бурному выделению из среза пузырьков кислорода.

Сделать вывод об активности каталазы в молодых и старых листьях элодеи.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.В чем принципиальное отличие между окислением при горении и окислением дыхательного субстрата при клеточном дыхании?

2.Какой класс ферментов участвует в процессах дегидрирования дыхательного субстрата?

3.Какова роль цитохромной системы и кислорода воздуха при дыхании?

4.Что такое интенсивность дыхания и дыхательный коэффициент?

5.Ферменты дыхания, их роль и значение.

60