Филиппович Ю.Б. - Основы Биохимии

в дисахаридах l,4-связи под действием (Х-амилазы не гидролизуются.

Если действие сх-амилазы распространяется на спирализованный участок молекулы крахмала или молекулы амилозы, то гидролиз 1,4-гликозидных

связей осуществляется латерально, вдоль одного бока спирализованного 1,4-

глюкана. Поскольку каждый виток спирали содержит 6-7 остатков ~-D­

глюкопиранозы, в результате гидролиза возникают гексаили гептасахарйды.

Такой механизм действия (Х-амилазы показан на рис. 103.

Гидролиз крахмала с помощью (Х-амилазы во всех случаях приводит к об­

разованию (х-формы мальтозы (см. с. 316), откуда ведет свое происхождение название фермента. (Х-Амилаза найдена у всех растительных и животных

видов; кроме крахмала она гидролизует также гликоген. ~олекулярная масса

(Х-амилазы из поджелудочной железы равна 45000, из солода- 59 000, из мучного хрущака-680ОО, из двух видов аспергилла-51000 и 58000, из

бактерий- 96 000 (4 х 24000). Выяснена первичная и третичная структура (Х­

амилазы из аспергилла.

Амило-l,б-глюкозидаза ускоряет реакцию гидролиза 1,6-связей в молекуле

крахмала (амилопектина), расщепляя, таким образом, молекулу крахмала

в точках разветвления полиглюкозидной цепи и образуя олигосахариды с тем или иным числом остатков (Х-D-глюкозы в них В зависимости от длины

отщепляемой цепи. Амило-l,6-глюкозидаза характерна для животных тканей. Однако это не значит, что ее нет в растительном мире: у растений этот же

фермент называют R-энзимом, а у микроорганизмов-изоамИлазоЙ.

Общая схема гидролиза крахмала при участии перечисленных выше фер­

ментов приведена на рис. 105.

Характерная особенность амилаз-отсутствие абсолютной специфичности

действия. При их участии mдролизуются различные соединения: амилоза,

амилопектин, гликоген, олигосахариды и родственные им вещества, по­

строенные из остатков (Х-D-глюкопиранозы и содержащие в молекулах 1,4-

и 1,6-связи. По-видимому, все амилазы являются металлопротеинами (содер-

ззо

Рис. 106. Третичная структура а·амилазы, продуцируемой Aspergillus orizae (така-амилаза А)

Молекула предСТВllл_ет эллипсоид (8.0 . 4,5 . 4,5 им), содержит 452 амиИОl<llслоt1lЬ!Х ocraTKa, чередование которых выясне­ но, а таl:же олиrосахарид, составленный из 2 остатков rЛЮJ;озамииа в 6 остатков мавнозы. Имеет IICBO выраженную двухдомеиную CЧJYJ<ТYPу; иа границе доменов располагается акТИВНЫЙ центр (А), включающий paдиll:алы acnараГИНО80Й

'КИCJ]оты н гистидинв, н CaJ +-связывающий центр (С); ОСТВТОК тирозина,. нависающий над активны.м центром, принимает, Ка)[ и Са", участие в связывании субстрата. lj>eтнчная CЧJУ"тура фИl<снруется четыРЬМJI -S-S-МOCТИI<ами

8а-сnиралей обозначены I1pJIМоугольнихами (HI-H8), а 8 Р-слоев-стpeлu.мв. Разрешение-О,З им

жат Zn2 + и Са2 +), некоторые из них мультимеры; предполагают, что ионы

металлов способствуют становлению молекулы мультимера из протомеров,

Активные центры амилаз образованы радикалами гистидина, аспарагино­

вой и глутаминовой кислот, а также тирозина (рис. 106). Последнему приписы­ вают функцию связывания субстрата, а первьiм трем-каталитическую функ­

цию. В соответствии с представлениями о структуре активного центра амилаз

предполагают на l-м этапе следующий механизм распада гликозидных связей

при их посредстве:

331

На 2-м этапе в активный центр фермента входит молекула воды, присое. динение ОН-группы которой обеспечивает распад возникшей сложноэфирной связи и высвобождение радикала дикарбоновой аминокислоты; протон воды

присоединяется к депротонированному на l-м этапе радикалу гистидина:

в результате восстанавливается структура активного центра фермента, и он

готов к осуществлению следующего каталитического акта в гидролизе глико­

зидной связи. Есть достаточно оснований считать, что не только амилазы, но

и все другие I'ликозидазы (см. ниже) деiiствуют в соответствии с приведенным

Bыllle механизмом.

Особую роль в осуществлении гидролиза гликозидных связей играют

имидазольвыe радикалы I'Истидина, присутствующие в каталитическом центре

амилаз. Именно при их посредстве идет перенос протонов, столь необходи­

мый для обеспечения каталитического акта. Такая функция радикалов гисти­

дина характерна и для каталитических центров ряда других гидролаз (см.

с. 229, 263 и 406).

Аналогично крахмалу и гликогену гидролизуются другие природные поли­

сахариды: целлюлозапри участии целлюлазноl'О комплекса ферментов (со­

стоит из эндо-l,4-~-глюканазы, экзоцеллобиогидролазы, целлобиазы и экзо- 1,4-~глюкогидролазы), инулин-с помощью инулиназы (2,I-Р-D-фруктан

фруктаногидролазы), хитин-хитиназы, ксилан-ксиланазы, гиалуроновая

кислота-rиaлуронидазы, пектиновые веществакомплекса пектинолитнче­

ских ферментов (пектинэстеразы, полигалактуроназы и др.) и т. п. Во всех

случаях полисахариды распадаются до соответствующих моносахаридов или

их производных (иногда до дисахаридов), из которых составлены молекулы указанных полисахаридов. Некоторые из гидролаз, перечисленных выше, ши­ роко распространены в природе, другие (целлюлаза, инулиназа)-присущи

лишь определенным видам растений, животных и микроорганизмов. Особое

внимание в последние годы привлекают целлюлазы, хитиназы, 1,3- и 1,6-Р­

глюканазы и лихеназы (гидролизуют гетерополисахариды с перемежающими­ ся 1,3- и 1,4-гликозидными связями), так как они деструктируют растительные

и микробные остатки, являющиеся экологически опасными отходами произ­ водства, позволяя при этом получать глюкозу и N-ацетилглюкозамин. Неко­ торые из них, например, хитиназы из Bacillus cereus, множественны (68, 52 и 38 кДа), выделены и очищены до гомогенного состояния; они ускоряют реакцию гидролиза хитина при рН = 4 и t = 600 С до хитобиозы, но не до

N-ацетил-Р-D-глюкозамина.

В свою очередь, дисахариды, возникающие в ряде случаев при гидролизе полисахаридов (мальтоза при гидролизе крахмала, целлобиоза при гидролизе

целлюлозы) или существующие в организме в свободном виде (лактоза,

332

сахароза, трегалоза и т. п.), гиДРолизуются при каталитическом воздействии

а.- и Р-гликозидаз до индивидуальных моносахаридов. Все гликозидазы, за исключением трегалазы (а., а.-трегалоза-глюкогидролазы), отличаются широ­

ким спектром специфичности, ускоряя гидролиз практически любых гликози­

дов, являющихся производными того или иного а.- или Р-моносахарида. Так,

а.-глюкозидаза ускоряет реакцию гидролиза а.-глюкозидов, в том числе маль­

тозы; Р-глюкозидаза- Р-глюкозидов, в том числе целлобиозы; р-галактозида­

за- Р-галактозидов и среди них лактозы и т. д. Примеры действия а. и f3-

глюкозидаз были приведены ранее.

Гликозидазы, кроме гидролазной активности, как правило, обладают также

гликозилтрансферазным действием и ускоряют процессы переноса гликозиль­

ных остатков на те или иные субстраты. Так, например, целлобиаза из аспергилла (М = 142000) при действии на целлобиозу образует не только Р-D-глюкозу, но И трисахариды, т. е. переносит остаток Р-D-глюкозы с одного дисахарида на другой, что особенно ярко выражено в начале ферментативного

процесса. Сейчас все более укрепляется мнение, что трансгликозилирование

является одним из существенных элементов распада полисахаридов, олигосаха­ ридов и дисахаридов, сопутствующих их гидролизу.

Второй тип распада полисахаридов и олшосахаридов представлен реакци­

ями фосфоролиза. Если попытаться выразить реакцию фосфоролиза в виде

суммарного химического уравнения, то она сводится к присоединению элемен­

тов фосфорной кислоты (водорода и кислотного остатка) по месту разрыва

гликозидной связи между остатками моносахаридов в молекулах олигоили

полисахаридов:

+

О-Н

n

Опираясь на это формальное представление, указанную реакцию расцени­

вали на первых порах как процесс, полностью аналогичный реакции гид­

ролиза, с тем лишь отличием, что роль воды в данной реакции играет НзРО4•

Поэтому она и была названа реакцией фосфоролиза. Эта реакция ускоряется

специфическими ферментами-фосфорилазами, которые относятся к под­

классу гликозилтрансфераз и подподклассу гексозилтрансфераз. Они бьUIИ

открыты я. о. Парнасом, К. Кори и Г. Кори более полувека тому назад.

Фосфорилазы ускоряют процесс переноса гликозильного остатка с невос­

станавливающего конца молекулы полисахарида или олшосахарида на неор­

ганический фосфат. Фосфоролитическому расщеплению подвергаются толь­

ко I,4-связи (см. уравнение реакции на с. 128 и 334).

Представленный выше процесс многократно повторяется, и ступенчатый распад а.-I,4-глюкана сопровождается выделением большого числа молекул

глюкозо-I-фосфата. В случае строго линейного полигликозида фосфоролиз

идет до конца, в случае разветвленных полисахаридов-останавливается

в точках разветвлений полисахаридной цепи.

333

ОН

1 _

+ НО-Р=О 1 -

6н

Реакция фосфоролиза полисахаридов широко представлена в природе. Именно так идет распад гликогена, когда он вступает на путь гликогенолиза

(см. ниже). Аналоmчно этому посредством реакции фосфоролиза значитель­

ная часть крахмала превращается в l"люкозо-l-фосфат при использовании запасов крахмала для нужд растительного организма. Отмечены также случаи

фосфоролиза дисахаридов. Так, некоторые бактерии содержат мальтозофос­

форилазу, ускоряющую реакцию распада мальтозы на глюкозо-l-фосфат и глюкозу при взаимодействии ее с НзРО4•

Фосфорилазы-мультимеры высокой молекулярной массы. Наиболее изу­

чена фосфорилаза из мышц кролика. Ее молекула (М= 400 000) состоит из

четырех протомеров (4х 100000), каждый из которых представлен полипеп-

I тидной цепью из 841 аминокислотного остатка.. Последовательность их рас­

положения установлена; в частности, выяснено, что в положении 14 находится

серин, фосфорилированный по ОН-группе радикала, а в положении 679-ли­

зин, с Е-аминогруппой которого альдиминной связью соединен пиридоксаль­

фосфат, являющийся простетической группой фосфорилазы. Электронно-мик­

роскопически выяснена и третичная структура протомеров, их топография, локализация субстратного и каталитического центров, JIространственная ком­

поновка мономеров в тетрамере (рис. 107). Именно в -таком состоянии, т. е. в виде тетрамера. гликогенфосфорилаза из мышц кролика проявляет высокую активность впереносе гликозильныx остатков на неорганический фосфат. Ее

называют фосфорилазой а.

Будучи дефосфорилирована по 14-му остатку фосфосерина каждого из

протомеров (это происходит при участии npотеинфосфатазы), тетрамерная

молекула фосфорилазы а распадается на две равные части (т. е. на два

димера), называемые фосфорилазой Ь, R частично теряет\ каталитическую

активность. После фосфорилирования протомеров в неполностью активных димерах фосфорилазы Ь тетрамерная структура восстанавливается и снова идет реакция фосфоролиза. Фосфорилирование димеров осуществляется при

участии киназы фосфорилазы Ь (о киназах см. с. 124), переносящей фосфат

с АТФ на радикал остатка серина, находящийся в 14-м положении в полипеп­

тидной цепи мономера. Становление тетрамера зависит от присутствия Mg2 +,

участвующего 8 образовании ионных связей между протомерами, в том числе,

вероятно, за счет фосфатных групп:

ЗЗ4

Киназа фосфорилазы Ь

2 фосфорилаза Ь+4 АТФ+'I===============-::' Фосфорилаза а+4 АДФ

Фосфорилаза ОI(азалась ферментом, исследование которого позволило впервые детально изучить вопрос о регуляции активности ферментов за

счет реакций фосфорилирования-дефосфорилирования (рис. 108). Дело

в том, что действие киназы фосфорилазы Ь, в свою очередь, тоже регулиру­

ется при помощи такого же механизма. Этот фермент имеет огромную

молекулярную Maccy-1272000 Да. Он построен из 4 субчастиц

с М = 318 000, каждая из которых, в свою очередь, составлена из трех

протомеров; два из них (А иВ) являются регуляторными, а один, С, несет

каталитическую функцию, т. е. ускоряет реакцию фосфорилирования фос­

форилазы Ь. Однако протомер С активен лишь в том случае, когда фосфо­

рилирован регуляторный протомер В и дефосфорилирован регуляторный

протомер А. Такой способ регуляции активности фермента получил назва­

ние регуляции за счет фосфорилирования второго регуляторного центра

(рис. 109).

Фосфорилирование протомера В, как, впрочем, и протомера А, когда

киназа фосфорилазы Ь инактивируется, в свою очередь, осуществляется при участии киназы, которая является, таким образом, киназой киназы фосфори­ лазы Ь. Крайне существенно, что она активна только в присутствии ал­ лостерического регулятора-циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), возникающеtо из АТФ в присутствии аденилатциклазы, деятельность которой

контролируется гормонально (см. рис. 108). Естественно, что попеременное

дефосфорилирование протомеров А и в при посредстве протеинфосфатазы тоже является условием регуляции активности киназы фосфорилазы Ь. Таким образом, активность фосфорилаз, как и, следовательно, процесс фосфоролиза

в целом, тонко регулируется.

'l.

А

Рис. 107. Четвертичная структура гликогенфосфорилазы мышц кро-

лика (А) и третичная структура протомера (Ь):

А-при вращении МОllели от 0-110 \800 ясно просле:.<ивается наличие четырех протом"ров

и их взаимное расположение в мультимере, Б-детали пространственного раCnОЛQже,mR ПОЛИJ1ептидной цепи опущены и показан лишь общий контур протомера; 1 - N-концеваR IlМИНОII:Jlслота; 841-С-концеваи аминокислота; l4-остаток серинфосфата; 679-остаток ЛН]ИJ18 с присаединенным" нему пиридоксальфосфатом; пунктирным кружхом обозначена локализация активиото центра, КОСОЙ штриховкой- субстратного центра, черным прямо­ утолы",,:ом-АМФ-СВRзывающиJl центр (АМФ-активатор фермента), треугольииком и точкой в зоне активного центра-места связываНИJl нуклеооидов и глюхозы (оба-

ингибиторы)

ззs

l-фосфат

Рис. 108. Реrуляция активности rликоrенфосфорилазы при посред­

стве протеинкиназных и протеинфосфатазных реакций (пояснение

втексте)

впоследние годы появились новые данные о структуре киназы фосфорила­

зы Ь и регуляции ее активности. Полагают, что ее субчастица (М=316000)

состоит из 4 протомеров (Ot-138000; Р-ll7000; "(-44000 и 0-17000),

аполная молекула-из 4 субчастиц (М = 1250000). Каталитическую функцию

несет протомер "(, регуляторную-протомеры Ot, ~ И О, причем последний

является Са2 +-зависимым и отождествляется в Са2 +-связывающим регуля­

торным белком кальмодулином.

Превращение моносахаридов. Как показано выше, при распаде

олиго- и полисахаридов возникают свободные монозы и их фосфорные эфиры. Дальнейший обмен моносахаридов идет такими путями, что используются

только фосфорные эфиры моносахаридов, свободные же монозы фосфорили­

руются, т. е. превращаются в фосфорные эфиры.

Фосфорилирование свободных моносахаридов-обязательная реакция на

пути их использования для нужд организма. Оно приводит к возникновению

более реакционноспособных, чем свободные моносахариды, фосфорных эфиров

моносахаридов и поэтому часто рассматривается как реакция активирования.

Фосфорилирование м:оносахаридов осуществляется при взаимодействии их

с АТФ и ускоряется специфическими (и неспецифическими) фосфотрансфераза­ МИ, которые называются также киназами. Фосфорилирование глюкозы, напри­

мер, идет согласно схеме:

ЗЗ6

Рис. 109. Реryляция активности киназы фосфОРИЛа3ы Ь (ПОJlснеипе в тексте)

IJJIO.,оаиназа (гексоmваза)

Глюкоза+АТФ ------- , Глюкозо-6-фосфат+АДФ

(АТФ: D·гmoJ[оза

б-фосфотрансфераза)

Уравнение этой реакции приведено выше (см. с. 124).

В природе обнаружено более двух десятков индивидуальных фосфотранс­ фераз, переносящих остатки фосфорной кислоты с АТФ на те или иные

моносахариды. Молекулы многих из них, как выяснено в последнее время,

построены из 2 субъединиц. Так, гексокиназа из дрожжей при- М = 102000

состоит из 2 субъединиц с М = 51 000 каждая и обнаружено 2 ее изозима;

галактокиназа из эритроцитов человека при М = 53 ооо-из 2 субъединиц по

27000 каждая; рибулокиназа из кишечной палочки при- М = 98 ООО-из 2 субъ­ единиц по 50000 каждая и т. п. Изучение третичной структуры субъединицы

Рис. 110. Конформационные изменения субъединицы молекулы гексокиназы в ороцессе

возникновения фермент-субстратного комплекса:

А-до прнсоедввеви. глlOIC03Ы (открыт&. коНформаци.); Б-после присоедииенИ8 глюкозы (,uрытlUl .,оифоро мации)_ Достаточно легко различимы два rлавных домена су6'ьединицы, п~ремещение "оторых обеспечивает измене-

337

дрожжевой гексокиназы выявило ее двухдоменную структуру и локализацию

связывания АТФ и глюкозы на дне щели между доменами, где, собственно,

и протекает процесс переноса фосфата при непременном участии Mg2 +. Выяс­

нены и более тонкие детали этого процесса, в частности переход субъединицы из открытой конформации в момент сорбции субстратов в закрытую в процес­ се осуществлении реакции (рис. 110).

Рассмотрим еще несколько примеров действия киназ. Так, фруктокиназа ускоряет реакцию образования фруктозо-б-фосфата:

Аналогично протекает взаимодействие между рибозой и АТФ:

Следовательно, практически любой моносахарид может быть переведен 8 фосфорный эфир. Именно в виде фосфорных эфиров и осуществляется дальнейший обмен моносахаридов.

Важнейшей особенностью фосфорных эфиров моносахаридов является их

способность к изомеризации. Последняя может осуществляться как за счет

стереоизомеризации (Т. е. изменении пространственного расположении атомов

и атомных групп в молекуле), так и в результате внутримолекулярного перено­

са атомов Н. Одним из примеров подобного рода превращепий служит пере­ ход глюкозо-б-фосфата в фРУКТОЗО-б-фосфат, интенсивно осуществляемый

в мышечной ткани и приводящий к установлению равновесия между этими двумя эфираМ1l в отношении 2: 1:

Приведем еще He:kOTOpbIe хараnерные 8 этом смысле реакции. Так, рибозо-

5-фосфат может превращаться в рибулозо-5-фосфат, а последний, в свою оче­

-редь,-в ксилулозо-5-фосфат:

ЗЗ8

~O

в первом случае происходит внутримолекулярный перенос водорода, во втором-изменение расположения в пространстве атома Н и ОН-группы при 3-м углеродном атоме. И тот и другой процессы ускоряются ферментами,

принадлежащими к классу изомераз.

Особенно леrко процесс перестройки одного моносахарида в другой протекает, если фосфорный эфир моносахарида соединен с уридин-S'-фос­

фатом. Примером может служить превращеnие галактозы в глюкозу и об­

ратно:

Если учесть, что в организме не только фосфорные эфиры моносахаридов,

но И свободные моносахариды могут превращаться друг в дрytа, то появля­ ется возможность перехода от любой гексозы или пентозы к любой другой, изомерной ей. Это имеет огромное значение. В природе и синтез и распад

моносахаридов, как и весь процесс обмена углеводов, протекает через некото­

рые их формы, занимающие в данном процессе ключевые позиции. Это,

в первую очередь. фосфорные эфиры двух моносахаридов: rЛЮ:kозо-6-фосфат и рибулозо-S-фосфат.

О б ме н гл ю к о з 0-6-ф ос Ф а т а. Глюкозо-6-фосфат образуете. в орга­

низме разными путями. Во-первых, он может синтезироваться путем фосфо­

рилирования глюкозы за счет ее взаимодействия с АТФ. Во-вторых, он образуется в результате реакции изомеризации фосфорных эфиров других изомерпых ему гексозофосфорных эфиров. В-третьих, оп получается из глю­ :козо-l-фосфата, который представляет собой продукт фосфоролиза олиго­

и полисахаридов. Две первые реакции рассмотрены в предьщущем разделе.

Что касается преобразования глюкозо-I-фосфата в глюкозо-6-фосфат, то эта

реакция протекает в два этапа при участии фермента фОСфОГЛlOкомутазы.

Молекулярная масса фермента из мышц кролика равна 62000; молекула фОСфоглюкомутазы состоит из двух субъединиц с М = 31000 каждая. Актив­

ный центр ее включает в свой состав остаток фосфосерина, с которого

339