знаем о биохимии генетической рекомбинации, была изначально получена в ходе исследования бактерии E. coli и поражающих ее вирусов. Затем эксперименты проводили на простых эукариотах типа дрожжей. При работе с такими организмами, обладающими коротким временем смены поколений и относительно маленькими геномами, появилась возможность получать большой набор мутантов с дефектами в процессах рекомбинации. Затем в каждом мутанте идентифицировали видоизмененный белок и в конечном счете изучили его биохимические свойства. Позже близких родственников этих белков обнаружили и детально охарактеризовали у дрозофилы, мышей и человека. Эти исследования показывают, что фундаментальные процессы, которые катализируют гомологичную рекомбинацию, являются общими для всех клеток, о чем мы сейчас и поговорим.
5.5.3. Гомологичная рекомбинация направляется комплементарными взаимодействиями между основаниями двух гомологичных ДНК дуплексов
Отличительный признак гомологичной рекомбинации — то, что она происходит только между двухцепочечными ДНК, которые имеют обширные области подобия (гомологии) последовательностей. Неудивительно, что в основе этого требования лежит спаривание оснований; и два дуплекса (так называют двухцепочечные молекулы ДНК) ДНК, которые претерпевают гомологичную рекомбинацию, проверяют последовательности ДНК друг у друга, вовлекая в спаривание на протяженных участках основания одной из нитей одного дуплекса ДНК и основания комплементарной ей нити из другого дуплекса. Для успешного протекания гомологичной рекомбинации соответствие не обязательно должно быть полным, но должно, по крайней мере, быть очень близким.
В своей простейшей форме спаривания оснований такого типа может быть сымитировано в пробирке — когда двойной спирали ДНК предоставляют возможность образоваться вновь из предварительно разделенных одиночных цепей. Этот процесс, названный ренатурацией ДНК (renaturation), или гибридизацией (hybridization), происходит в том случае, если в результате редкого случайного столкновения совместятся комплементарные последовательности нуклеотидов в двух соответствующих друг другу одинарных цепях ДНК и в силу этого между ними сформируется короткий отрезок двойной спирали. Этот относительно медленный шаг зарождения спирали сопровождается очень быстрым шагом «застегивания молнии», когда область двойной спирали распространяется, чтобы максимально увеличить число спаренных оснований (рис. 5.54).
Для образования новой двойной спирали таким способом необходимо, чтобы отжигаемые (гибридизующиеся) нити находились в открытой, развернутой конформации. По этой причине реакции гибридизации in vitro выполняют или при высокой температуре, или в присутствии органического растворителя типа формамида; в таких условиях «расплавляются» короткие шпилечные спирали, которые образуются в результате взаимодействий между комплементарными основаниями в пределах одной цепи, что приводит к замыканию цепи на себя. Большинство клеток не может пережить такие жесткие условия и, вместо этого, использует белки, связывающие одноцепочечную ДНК (см. стр. 419) для разрушения шпилечных спиралей. Белки, связывающие одноцепочечную ДНК, важны для репликации ДНК (как описано ранее), а также для гомологичной рекомбинации; они связываются сильно и коопера-
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 469
Рис.5.54.ГибридизацияДНК.ДвойныеспиралиДНКформируютсяповторноизотдельныхцепейвходе реакции,котораязависитотслучайногостолкновениядвухкомплементарныхцепейДНК.Подавляющее большинство таких столкновений не будет продуктивным, как это показано слева, но некоторые, хотя инемногочисленные,даюткороткуюобласть,вкоторойсформировалиськомплементарныепарыоснований (зарождение, или нуклеация, спирали). Затем быстрое «застегивание» ведет к формированию полнойдвойнойспирали.Такимвотметодом«пробиошибок»цепьДНКнаходитсебекомплементарного партнерадажесредимиллионовнесоответствующихей цепейДНК.
тивно с сахарофосфатным остовом всех одноцепочечных областей ДНК и удерживают их в растянутой конформации с выставленными наружу основаниями (см. рис. 5.16 и 5.17). В такой растянутой конформации одинарная нить ДНК может эффективно взаимодействовать либо с комплементарными основаниями, либо с молекулами нуклеозидтрифосфата (при репликации ДНК), либо с комплементарным отрезком другой одинарной цепи ДНК (как часть процесса генетической рекомбинации).
В результате гибридизации ДНК создается область спирали, образованная цепями, которые происходят от двух разных молекул ДНК. Формирование такой области, известной как гетеродуплекс, является важным этапом в любом процессе гомологичной рекомбинации. Поскольку львиная доля ДНК в клетке двухцепочечная, «пробирочная» модель гибридизации ДНК не может в полной мере объяснить, как этот процесс происходит в клетке. Действительно, для запуска гомологичной рекомбинации между двумя двухцепочечными молекулами ДНК с подобными последовательностями нуклеотидов необходимы специальные механизмы. Крайне важными участниками этих механизмов являются белки, которые позволяют осуществлять гибридизацию ДНК в клетке посредством внедрения цепи (инвазии цепи) — спаривания участка одноцепочечной ДНК с комплементарной цепью в другой двойной спирали ДНК, — как мы опишем далее.
5.5.4. Белок RecA и его гомологи способствуют спариванию одинарной цепи ДНК с гомологичной областью двойной спирали ДНК
Поскольку широкомасштабные комплементарные взаимодействия пар оснований не могут произойти между двумя неповрежденными двойными спиралями ДНК, гибридизация ДНК, которая является критически важной для гомологичной рекомбинации, может начаться только после того, как цепь ДНК из одной спира-
470 Часть 2. Основные генетические механизмы
ли освободится от спаривания с комплементарной ей нитью и, таким образом, ее нуклеотиды станут доступными для комплементарного взаимодействия со второй спиралью ДНК. В примере, который был ранее представлен на рис. 5.53, такая свободная одинарная нить образуется, когда репликационная вилка упирается в разрыв на ДНК, разваливается (создавая новый двунитевой конец), и экзонуклеаза деградирует 5′-конец разрыва, оставляя неспаренным его 3′-конец. В других приложениях гомологичной рекомбинации однонитевые области создаются подобными этому способами, о чем мы поговорим позже.
На одинарную цепь на 3′-конце ДНК воздействует несколько специализированных белков, которые направляют ее инвазию в дуплекс гомологичной ДНК. Первым по важности идет белок RecA (его название у E. coli) и его гомолог Rad51 (его название в организмах практически всех эукариот) (рис. 5.55). Подобно белку, связывающему одноцепочечную ДНК, белок RecA связывается с одноцепочечной ДНК прочно в виде протяженных кооперативных кластеров, образуя таким образом нуклеопротеиновый филамент. Поскольку каждый мономер RecA имеет более одного участка связывания с ДНК, то нить из белков RecA может удерживать одноцепочечную ДНК и двойную спираль ДНК вместе (рис. 5.56). Такое взаимное расположение позволяет белку RecA катализировать многоступенчатую реакцию синапсиса ДНК, которая происходит между двойной спиралью ДНК и гомологичной областью однонитевой ДНК. На первом этапе белок RecA переплетает однотяжевую ДНК с дуплексом ДНК независимым от последовательности образом. Затем одинарная нить ДНК «ищет» в дуплексе гомологичные последовательности. В точности не известно, как именно происходят этот поиск и окончательное опознавание оснований, но они могут вовлекать кратковременное образование комплементарных пар между
Рис. 5.55. Структура филаментов, образованных из белков RecA и Rad51 и ДНК. а) Белок Rad51 — при-
сущийчеловекугомологбелкаRecAбактерий—связансоднотяжевойДНК.Триследующихдругзадругом белковых мономера в этом спиральном филаменте окрашены. б) Короткий сегмент RecA-филамента: сизображениемфиламента,строениекоторогобылоопределеноэлектронноймикроскопией,совмещена трехмернаяструктурабелкаRecA.НаодинвитокспиралиприходитсяоколошестимономеровRecA,удерживающих18нуклеотидоводноцепочечнойДНК,котораярастянутабелком.ТочнаяконфигурацияДНКвэтой структуренеизвестна.(ИзображениеалюбезнопредоставилEdwardEgelman;снимокбзаимствованизX. Yu etal.,J.Mol.Biol.283:985–992,1998.СблагосклонногоразрешенияиздательстваAcademicPress.)
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 471
что между одиночной цепью ДНК (красной), покрытой белком RecA (синий), и двойной спиралью ДНК (зеленый) образуются комплексы нескольких типов. Сначала это не спаренный основаниями комплекс, которыйпреобразуетсяв«сцепленнуюмолекулу»,кактолькогомологичнаяпоследовательностьобнару- жена.ЭтоткомплексдинамиченираскручиваетгетеродуплексДНК(однанитьзеленая,вторая—красная) плюсвытесненнуюизисходнойспиралиединичнуюнить(зеленая).Такимобразом,структура,показанная на этой схеме, перемещается влево, втягивая «входящие ДНК» и выпуская «выходящие ДНК». (Перера-
ботаноизS. C. West,Annu.Rev.Biochem.61:603–640,1992.СлюбезногоразрешенияAnnualReviews.)
основаниями одинарной нити и основаниями, выпячиваемыми наружу из дуплекса ДНК (см. рис. 5.49). Как только гомологичная последовательность будет найдена и ее местоположение установлено, происходит инвазия: одиночная нить вытесняет одну из нитей дуплекса, по мере того как она образует обычные пары оснований с другой нитью. В конечном итоге образуется гетеродуплекс — область двойной спирали ДНК, образованная комплементарным взаимодействием оснований двух цепей ДНК, которые изначально были частями двух разных молекул ДНК (см. рис. 5.56).
Поиск гомологии и внедрение одинарной нити
вдуплекс ДНК суть ключевые реакции, которые запускают гомологичную рекомбинацию. Они требуют,
вдополнение к RecA-подобным белкам и белкам, связывающим одноцепочечную ДНК, наличия нескольких белков со специализированными функциями. Например, белок Rad52 вытесняет белки однонитевого связывания, обеспечивая тем самым посадку молекул Rad51, и, кроме того, индуцирует отжиг комплементарных одинарных цепей (рис. 5.57).
Рис.5.57.СтруктурачастибелкаRad52.а)Этабаранкоподобная структура состоит из 11 субъединиц. б) Однонитевая ДНК «уложена» внутрь глубокой бороздки, идущей вдоль поверхности белка. Основания ДНК выставлены наружу. Предположительно, такая конфигурация опосредует отжиг двух комплементарных одинарныхцепей.(ЗаимствованоизM. R. Singletonetal.,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 99: 13492–13497, 2002. С любезного разрешения NationalAcademyofSciences.)
472 Часть 2. Основные генетические механизмы
Короткая гетеродуплексная область формируется в том месте, где вторгшаяся одиночная нить спарилась с комплементарной ей в дуплексе ДНК, и часто значительно увеличивает свою протяженность в ходе процесса, названного миграцией точки ветвления, о котором мы сейчас и поговорим.
5.5.5. Миграция точки ветвления может как расширять гетеродуплексные области, так и высвобождать новосинтезированную ДНК в виде одиночной цепи
Как только реакция инвазии произошла, точка обмена нитями («точка ветвления») может передвигаться посредством процесса, названного миграцией точки ветвления (branch migration) (рис. 5.58). В ходе этой реакции неспаренная область одной из одиночных цепей вытесняет спаренную область другой одиночной цепи, перемещая точку ветвления без изменения общего числа пар оснований ДНК. Хотя самопроизвольная миграция точки ветвления может происходить, она совершается одинаково в обоих направлениях, так что в общем точка продвигается совсем ненамного (рис. 5.58, а). Однако специализированные ДНК-хеликазы способны катализировать однонаправленную миграцию точки ветвления, легко образуя область гетеродуплексной ДНК, которая может насчитывать тысячи пар оснований
вдлину (рис. 5.58, б).
Ваналогичной реакции синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразой, может приводить в действие процесс однонаправленной миграции точки ветвления, посредством которого новосинтезированная ДНК вытесняется в виде одинарной нити, имитируя способ, которым новосинтезированная цепь РНК высвобождается РНК-полимеразой. Такая форма синтеза ДНК, кажется, используется в несколь-
тах. а) Спонтанная миграция точки ветвления представляет собой процесс возвратно-поступательного случайногоблуждания,ипоэтомуеепродвижениевмасштабедлинныхрасстоянийсовсемнебольшое. б) Направляемая белками миграция точки ветвления требует энергии и перемещает точку ветвления спостояннойскоростьюводномнаправлении.
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 473
ких процессах гомологичной рекомбинации, в том числе и в процессах устранения двухцепочечных разрывов, которые будут описаны далее.
5.5.6. Гомологичная рекомбинация может безупречно репарировать двухцепочечные разрывы ДНК
Ранее в этой главе мы обсуждали внушающие ужас проблемы, создаваемые двухцепочечными разрывами в ДНК, и увидели, что клетки могут устранять такие разрывы двумя путями. Негомологичное соединение концов (см. рис. 5.51) происходит без участия матрицы и создает мутацию на участке, в котором два дуплекса ДНК сцеплены. Кроме того, ее действием могут быть случайно сведены воедино сегменты из двух разных хромосом и тем самым осуществлены хромосомные транслокации, многие из которых имеют серьезные последствия для клетки.
Вотличие от негомологичного соединения концов, гомологичная рекомбинация может со всей точностью устранять двунитевые разрывы без какой-либо потери или видоизменения нуклеотидов на участке восстановительных работ (рис. 5.59).
Вбольшинстве клеток опосредствованное рекомбинацией устранение двунитевых разрывов происходит только после того, как клетка реплицирует свою ДНК, и поэтому один из ближайших дочерних дуплексов ДНК может служить матрицей для восстановления второго.
Гомологичная рекомбинация может быть использована также для устранения повреждений ДНК многих других типов, благодаря чему она выступает, возможно, наиболее универсальным механизмом репарации ДНК из имеющихся в арсенале клетки; «многоцелевой» характер рекомбинационного восстановления, вероятно, и объясняет причину, по которой его механизм и белки, что приводят его в действие, остались консервативными практически во всех клетках на Земле.
5.5.7. Клетки тщательно регулируют степень использования гомологичной рекомбинации для репарации ДНК
Хотя гомологичная рекомбинация ловко решает проблему точного исправления двунитевых разрывов и повреждений ДНК других типов, она вместе с тем представляет определенную опасность для клетки и поэтому должна жестко регулироваться. Например, последовательность ДНК в одном хромосомном гомологе может стать функционально неактивной при «ремонте» ее с использованием другого хромосомного гомолога в качестве матрицы. Потеря гетерозиготности такого типа часто оказывается решающим моментом в формировании раковых образований (о чем будет сказано подробнее в главе 20), и клетки имеют (еще плохо изученные) специальные механизмы, чтобы минимизировать ее. Хотя потеря гетерозиготности относительно редка в нормальных клетках, ее можно рассматривать как нежелательный побочный эффект многофункциональности гомологичной рекомбинации.
Другой тип «надзора» над рекомбинационной репарацией, который встречается почти во всех клетках эукариот, предотвращает основанную на рекомбинации «репарацию» при отсутствии повреждения ДНК. Ферменты, которые катализируют рекомбинационную репарацию, у эукариот обычно вырабатываются на относительно высоких уровнях и рассредоточиваются по всему ядру. В ответ на повреждение ДНК они быстро направляются к участкам повреждения и в конечном счете образуют «ремонтные фабрики», на которых устраняются многие повреждения ДНК (рис. 5.60). Такая срочная мобилизация белков репарации к поврежденной ДНК
ЭтопредпочтительныйметодустранениядвунитевыхразрывовДНК,которыевозникаютвскорепосле того, как ДНК была реплицирована и две сестринские хроматиды все еще скреплены одна с другой. В этом процессе участвуют многие из тех же белков, что и в представленном на рис. 5.53 механизме, ипротекаетончерезтежеосновныепромежуточныешаги.Вообще,гомологичнаярекомбинацияможет быть расценена как гибкий ряд реакций, точный путь протекания коих отличается от случая к случаю. Например,длинавосстановительной«заплаты»можетизменятьсявширокихпределахвзависимости от степени 5'-процессинга, миграции точки ветвления и синтеза новой ДНК. (См. М. McVey, J. LaRocque, M. D. Adams,andJ. Sekelsky,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:15694–15699,2004.)
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 475
Рис. 5.60. Эксперимент, демонстрирующий быструю мобилизацию белков репарации к местам двухцепочечных разрывов ДНК. Фибробласты человека подвергали рентгеновскому облучениюсцельюсозданиядвухцепочечныхразрывовДНК.Преждечемрентгеновскиелучиударилипоклеткам,ихпропустили черезмикроскопическуюсеткуспоглощающимирентгеновские лучи«полосками»,расположеннымичерез1мкмдруготдруга. ВрезультатеобразоваласьполосчатаякартинаповрежденияДНК, позволившая сравнить поврежденную и неповрежденную ДНК водномитомжеядре.а)ВсяДНКвядрефибробласта,окрашенном красителем DAPI. б) Участки синтеза новой ДНК, проявляющиесязасчетвключенияBrdU2 (аналогатимина)ипоследующего окрашиваниясвязаннымисFITC3 антителамикBrdU.в)Скопление комплексов Mre11 в местах повреждения ДНК, наблюдаемое спомощьюкрасителяТехаs-red,конъюгированногосантителами ксубъединицеMre11.Высказанопредположение,чтокомплекс Mre11 изначально распознает двунитевые разрывы в клетке, а затем мобилизует дополнительные белки для «залечивания» разрывов путем гомологичной рекомбинации (см. рис. 5.59). Препараты а, б и в обрабатывали красителями спустя 30 минут послеоблучения.(ЗаимствованоизB. E. Nelmsetal.,Science280: 590–592,1998.СлюбезногоразрешенияиздательстваAAAS.)
четко управляется клеткой и требует ряда вспомогательных белков. Два из них, белки Brca1 и Brca2, были впервые обнаружены в связи с тем, что мутации в их генах приводят к резкому повышению частоты заболеваемости раком молочной железы. В то же время удаление белка, необходимого для гомологичной рекомбинации (такого как белок человека Rad51), убьет клетку, а видоизменение в любом вспомогательном белке может снизить эффективность репарации. Как результат — накопление повреждений ДНК в небольшой доле клеток может дать начало раку. Белок Brca2 связывается с белком Rad51, предотвращая его полимеризацию на ДНК и таким образом поддерживая его в неактивной форме. Полагают, что белок Brca2 помогает быстро доставлять белок Rad51 к участкам повреждения и высвобождать его там уже в активной форме.
В главе 20 мы увидим, что и слишком большой, и слишком малый уровни гомологичной рекомбинации у людей могут приводить к раку: первый — через потерю гетерозиготности, а последний — через увеличенную частоту мутаций, вызванную неэффективностью репарации ДНК. Ясно, что в горниле эволюции был выкован чувствительный механизм, который держит этот процесс под контролем в случае неповрежденной ДНК и в то же время позволяет ему действовать эффективно и быстро при повреждении ДНК.
Бактерии тоже тщательно регулируют деятельность ферментов, отвечающих за рекомбинацию и репарацию ДНК, но это происходит главным образом путем управления уровнями их концентраций внутри клетки. В ответ на серьезное повреждение ДНК у E. coli увеличивается транскрипция многих ферментов репарации ДНК — как часть так называемой реакции SOS, или SOS-репарации. В их числе ферменты репарации, работающие по механизму вырезания нуклеотидов; исправ-
25-бромдезоксиуридин. — Прим. пер.
3Флуоресцеинизотиоцианат. — Прим. пер.
476 Часть 2. Основные генетические механизмы
ляющие ошибки ДНК-полимеразы, которые умеют использовать поврежденную ДНК в качестве матрицы; и белки, которые опосредуют гомологичную рекомбинацию.
Исследования мутантных бактерий с нарушением различных составляющих SOS-репарации показывают, что недавно синтезированные белки имеют два эффекта. Во-первых, как и следовало ожидать, индукция таких дополнительных ферментов репарации ДНК повышает выживаемость клетки после повреждения ДНК. Вовторых, несколько из индуцируемых белков кратковременно увеличивают частоту мутаций, повышая число ошибок, допускаемых при копировании последовательностей ДНК. Эти ошибки обусловлены производством ДНК-полимераз низкой точности, которые могут эффективно использовать поврежденную ДНК в качестве матрицы для синтеза ДНК. Тогда как такое «подверженное ошибкам» восстановление ДНК может быть губительно для отдельных клеток бактерий, в долгосрочной перспективе оно, по-видимому, является преимуществом, потому что производит
впопуляции бактерий всплеск генетической изменчивости, который увеличивает вероятность появления мутантной клетки, более приспособленной к выживанию
визменившейся окружающей среде.
5.5.8. В ходе гомологичной рекомбинации часто образуются структуры Холлидея
Гомологичную рекомбинацию можно рассматривать как серию взаимосвязанных реакций, которая использует внедрение одинарной нити, миграцию точки ветвления и ограниченный синтез ДНК для обмена ДНК между двумя двойными спиралями с подобными друг другу последовательностями нуклеотидов. Обсудив вклад гомологичной рекомбинации в точность репарации поврежденной ДНК, теперь мы обратимся к ней как к средству создания молекул ДНК с новой последовательностью. В ходе этого процесса часто образуется специальный промежуточный продукт ДНК, который содержит четыре нити ДНК, поделенные между двумя спиралями ДНК. В этом ключевом промежуточном продукте, известном как структура Холлидея (Holliday junction), образующемся в процессе обмена с перекрещиванием цепей (cross-strandedexchange), две двойных спирали ДНК перекрестно обмениваются партнерами. Структура Холлидея может принимать множество конформаций, и специальный набор рекомбинационных белков связывается с открытым, симметричным изомером и таким образом стабилизирует его (рис. 5.61). Используя энергию гидролиза ATP для координирования реакций миграции двух ветвей, эти белки могут быстро перемещать точку, в которой соединены обе спирали ДНК, по этим двум спиралям (рис. 5.62).
Четырехцепочечные структуры ДНК, образующиеся в ходе гомологичной рекомбинации, присутствуют в клетках лишь кратковременно. Таким образом, чтобы
Рис.5.61.СтруктураХоллидея.Изначальнооб-
разуемуюструктуруобычноизображаютдвумя перекрещивающимися (внутренними) нитями и двумя неперекрещивающимися (внешними) нитями. В результате изомеризации структуры Холлидея образуется открытая, симметричная структура. Это форма, с которой связаны белки RuvAиRuvB(см.рис.5.62).СтруктураХоллидея быланазванапоимениученого,которыйвпервыепредположилееобразование.
Глава 5. Репликация, репарация и рекомбинация ДНК 477
УE.coliтетрамербелкаRuvA(зеленый)идвагексамерабелкаRuvB(бледно-серый)связанысоткрытой формой структуры. Белок RuvB, который напоминает гексамерные хеликазы, принимающие участие в репликации ДНК (рис. 5.15), использует энергию гидролиза ATP для быстрого перемещения точки перекреста спаренных спиралей ДНК, расширяя тем самым гетеродуплексную область, как показано нарисунке.(ИзображениелюбезнопредоставленоP. Artymiuk;переработаноизS. C. West,Cell94: 699–701, 1998.СблагосклонногоразрешенияиздательстваElsevier.)
восстановить две отдельные спирали ДНК и, следовательно, завершить процесс рекомбинации, цепи, соединяющие эти две спирали в структуре Холлидея, должны в конечном счете быть разрезаны, каковой процесс был назван разрешением (resolution). У бактерий, где мы понимаем этот процесс лучше всего, специализированная эндонуклеаза (названная RuvC) расщепляет структуру Холлидея, оставляя надрезы в ДНК, которые ДНК-лигаза может легко заделать. Однако во время мейотических процессов, в ходе которых у эукариот образуются клетки зародышевой линии (у животных это сперматозоиды и яйцеклетки), механизмы «разрешения», по-видимому, намного сложнее.
Как будет сказано в главе 21, интенсивная гомологичная рекомбинация происходит как неотъемлемая часть процесса, посредством которого хромосомы распределяются по зародышевым клеткам в ходе мейоза. Результатом таких событий рекомбинации являются как кроссинговер, или перекрест (crossing over), хромосом, так и конверсия генов (gene conversion), дающие гибридные хромосомы, которые содержат генетическую информацию и от материнских, и от отцовских гомологов (рис. 5.63, а).
Как мы увидим в дальнейшем, во время мейоза и кроссинговер, и конверсия генов генерируются механизмами гомологичной рекомбинации, которые, в сущности, напоминают те, что используются для устранения двухцепочечных разрывов.
