648 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.7.13.Гомеодомен,связанныйсоспецифическойпоследовательностьюДНК.Показаныдверазные проекции одной и той же структуры. а) Гомеодомен свернут в три α-спирали, которые плотно упакованы при помощи гидрофобных взаимодействий. Участок, включающий спирали 2 и 3, напоминает мотивспираль-поворот-спираль.б)Узнающаяспираль(спираль3,красная)образуетважныеконтакты с большой бороздкой ДНК. Например, как показано на рис. 7.9, аспарагин (Asn) спирали 3 контактирует с аденином. Подвижное плечо, связанное со спиралью 1, контактирует с нуклеотидными парами в малой бороздке. Представленный здесь гомеодомен является частью регуляторного белка дрожжей, нооноченьблизконапоминаетгомеодоменымногихэукариотическихорганизмов.(Адаптированоиз
C. Wolbergeretal.,Cell67:517–528,1991.СразрешенияElsevier.)
что гомеодоменный белок дрожжей и гомеодоменный белок дрозофилы обладают очень похожей конформацией и узнают ДНК практически одинаковым образом, хотя они идентичны только по 17 из 60 аминокислот (см. рис. 3.13).
7.2.7. Существует несколько видов связывающихся с ДНК мотивов типа «цинковый палец»
Мотив спираль-поворот-спираль состоит исключительно из аминокислот, а вторая важная группа связывающихся с ДНК мотивов содержит в качестве структурных компонентов один или более атомов цинка. Все подобные цинк-координированные мотивы, связывающиеся с ДНК, называются «цинковыми пальцами» (zink fingers), но это описание относится только к их внешнему виду на схематических изображениях со времени их первого открытия (рис. 7.14, а). Последующие структурные исследования показали, что они делятся на несколько различающихся по структуре групп, две из которых мы здесь рассмотрим. Первый тип первоначально открыт у белков, активирующих транскрипцию гена рибосомной РНК эукариот. Он обладает простой структурой, в которой цинк удерживает вместе α-спираль и β-слой (рис. 7.14, б). Подобный тип «цинкового пальца» часто находят в тандемных кластерах, где α-спираль каждого из участников может контактировать с большой бороздкой ДНК, образуя практически непрерывный участок α-спиралей вдоль бороздки. Таким образом, сильное и специфическое взаимодействие ДНК–белок создается на основе повторяющихся основных структурных элементов (рис. 7.15).
Другой тип «цинкового пальца» обнаружен у большого семейства внутриклеточных рецепторных белков (подробно описано в главе 15). В этом случае образуется
Глава 7. Контроль генной экспрессии 649
Рис. 7.14. Один из типов «цинковых пальцев». Этот белок относится к семейству Cys-Cys-His-His белков, содержащих «цинковый палец», названных так согласно аминокислотам, удерживающим цинк. а)Схематичноеизображениеаминокислотнойпоследовательности«цинковогопальца»белкалягушки, принадлежащего к подобному классу. б) Трехмерная структура того же типа «цинкового пальца», состоящего из антипараллельного β-листа (аминокислоты 1–10), за которым следует α-спираль (аминокислоты 12–24). Четыре аминокислоты, которые связывают цинк (Cys 3, Cys 6, His 10 и His 23), прочно удерживают один конец α-спирали с одним из концов β-слоя. (Адаптировано из M. S. Lee et al. Science
245:635–637,1989.СразрешенияAAAS.)
структура иного вида (схожая в некотором отношении с мотивом спираль-поворот- спираль): здесь две α-спирали упакованы вместе с атомами цинка (рис. 7.16). Эти белки, так же как и белки с мотивом спираль-поворот-спираль, обычно образуют димеры, которые позволяют одной из двух α-спиралей от каждой субъединицы взаимодействовать с большой бороздкой ДНК. Два описываемых в этой главе типа «цинковых пальцев» различаются по структуре, но обладают двумя важными одинаковыми чертами: оба используют цинк в качестве структурного компонента и оба используют α-спираль для узнавания большой бороздки ДНК.
7.2.8. β-слои также могут узнавать ДНК
У рассмотренных до этого ДНК-связывающих мотивов α-спирали являются основным механизмом, используемым для узнавания специфических последовательностей ДНК. Однако одна большая группа регуляторных белков использует совершенно иной способ распознавания. В данном случае информацию на поверхности большой бороздки «считывает» двухцепочечный β-слой с боковыми цепями аминокислот, протянувшимися от β-слоя к ДНК (рис. 7.17). Как и в случае с распознаванием при помощи α-спирали, этот мотив из β-слоев может быть использован для узнавания множества различных последовательностей ДНК. Вид конкретно узнаваемой последовательности ДНК зависит от последовательности аминокислот, которые составляют β-слой.
650 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 7.15. Связывание белка, содержащего «цинковый палец», с ДНК. а) Структура фрагмента регу-
ляторного белка мыши, связанного со специфическим участком ДНК. Этот белок распознает ДНК при помощи трех «цинковых пальцев» типа Cis-Cis-His-His (см. рис. 7.14), располагающихся как прямые повторы.б)ТрипальцаимеютсхожиеаминокислотныепоследовательностииконтактируютсДНКсходным образом.Нааибатомцинкаукаждого«пальца»изображенввиденебольшогошарика.(Адаптировано изN. PavletichandC. Pabo,Science252:810–817,1991.СразрешенияAAAS.)
Рис.7.16.Димердоменатипа«цинковыйпалец»,принадлежащийсемействувнутриклеточныхрецепторов,связанныйсоспецифическойпоследовательностьюДНК.Каждыйдомен«цинковогопальца»содержит дваатомацинка(обозначенынебольшимисерымишариками):одинстабилизируетузнающуюДНКспираль (показана коричневым цветом в одной субъединице и красным — в другой), а другой стабилизирует петлю (показана фиолетовым цветом), участвующую в образовании димера. Каждый атом цинка скоординирован четырьмя остатками цистеина, расположенными соответствующим образом. Как и в белках с мотивом спираль-поворот-спираль, представленных на рис. 7.11, две узнающие спирали димера разделены друг от другарасстоянием,соответствующимодномувиткуспиралиДНК.Вкачествеконкретногопримераприведена частьглюкокортикоидногорецептора—белка,посредствомкоторогоклеткиопределяютналичиеиреагируют (науровнетранскрипции)надействиеглюкокортикоидныхгормонов,синтезируемыхнадпочечникамипри стрессе.(АдаптированоизB. F. Luisietal.,Nature352:497–505,1991.СразрешенияMacmillanPublishersLtd.)
Глава 7. Контроль генной экспрессии 651
Рис. 7.17. Бактериальный белок-репрессор метионинового оперона. Метиониновый репрессор бак-
терийрегулируетгены,которыекодируютферменты,катализирующиесинтезметионина.Приизбытке этой аминокислоты она связывается с репрессором, вызывая изменение его структуры, что позволяет этомубелкупрочносвязыватьсясДНК,выключаясинтезферментов.а)ДляпрочногосвязываниясДНК метиониновый репрессор должен образовать комплекс с S-аденозилметионином, который выделен красным.Однасубъединицабелковогодимерапоказаназеленымцветом,другая–голубым.Связываю- щийсясДНКдвухцепочечныйβ-слойсодержитпооднойцепиоткаждойсубъединицы;цепиобозначены темно-зеленымисинимцветами.б)УпрощеннаясхемасвязыванияметиониновогорепрессораиДНК, показывающая, как двухцепочечный β-слой репрессора связывается с большой бороздкой ДНК. Для упрощения другие участки репрессора не показаны. (а — адаптировано из S. Phillips, Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 89–98, 1991, с разрешения Elsevier; б — адаптировано из W. Somers and S. Phillips, Nature 359: 387–393,1992,сразрешенияMacmillanPublishersLtd.)
7.2.9. У некоторых белков для узнавания ДНК используются петли, которые входят в большую и малую бороздки ДНК
Несколько связывающихся с ДНК белков используют для считывания нуклеотидной последовательности не α-спирали и β-листы, а выступающие пептидные петли. Например, белок p53, важный опухолевый супрессор (tumor suppressor) человека, при помощи таких петель узнает нуклеотидные пары в большой и малой бороздках (рис. 7.18). Нормальная функция p53 заключается в строгом регулировании роста и пролиферации клетки. Оценить важность данного белка позволяет следующий факт: почти половина всех раковых клеток человека приобретает соматические мутации в гене белка p53, и, как будет видно в главе 20, этот этап является ключевым в развитии множества опухолей. Многие из отмеченных в раковых клетках мутаций p53 разрушают или изменяют его связывание с ДНК; действительно, при раке человека наиболее часто в белке p53 мутирован аминокислотный остаток Arg 248, который контактирует с малой бороздкой ДНК
(см. рис. 7.18).
7.2.10. Мотив «лейциновая молния» опосредует как связывание с ДНК, так и димеризацию белка
Многие регуляторные белки распознают ДНК как гомодимеры, вероятно, из-за того, что, как мы видели, это является самым простым способом достичь сильного специфического связывания (см. рис. 7.12). Обычно часть белка, отвечающая за димеризацию, отличается от части, ответственной за связывание с ДНК. Однако
652 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 7.18. Распознавание ДНК белком p53. Самые важные контакты с ДНК образуютаргинин248илизин120,которые отходятотвыступающихпетель,входящих внутрь малой и большой бороздок. Для сворачивания белка p53 требуется атом цинка(показанввидесферы),носпособ, которымцинкудерживаетсявэтойструктуре, совершенно отличается от способа, используемогосодержащими«цинковый палец»белками,описаннымиранее.
один мотив просто и практично сочетает в себе обе эти функции. Он называется мотив «лейциновая
молния», получив свое имя изза способа, каким две α-спирали, по одной от каждого мономера, соединяются вместе и образуют короткую биспираль (см. рис. 3.9). Спирали удерживаются вместе с помощью взаимодействий между гидрофобными боковыми
цепями аминокислот (чаще всего лейцина), отходящими от одной стороны каждой цепи. Сразу же за областью димеризационного контакта две α-спирали расходятся и образуют Y-образную структуру, которая позволяет их боковым цепям контактировать с большой бороздкой ДНК. Таким образом, димер захватывает двойную спираль, как прищепка бельевую веревку
(рис. 7.19).
Рис. 7.19. Димер «лейциновой молнии», связанный с ДНК. Два α-спиральных связывающихся с ДНК домена (внизу) димеризуются в α-спиральной области «лейциновоймолнии»(вверху)иобразуютперевернутую Y-образную структуру. Каждое плечо Y-структуры образовано одной α-спиралью (по одной от каждого мономера), опосредующей связывание со специфической последовательностью ДНК в большой бороздке. Каждаяα-спиральсвязываетсясполовинойсимметрич- ной структуры ДНК. Приведена структура белка Gcn4 дрожжей,регулирующеготранскрипциювзависимости отналичияаминокислотвокружающейсреде.(Адапти-
рованоизT. E. Ellenbergeretal.,Cell71:1223–1237,1992.
СразрешенияElsevier.)
Глава 7. Контроль генной экспрессии 653
7.2.11. Гетеродимеризация расширяет набор распознаваемых регуляторными белками последовательностей ДНК
Многие из до этого рассмотренных нами регуляторных белков связываются с ДНК как гомодимеры, то есть как димеры, состоящие из двух одинаковых субъединиц. Однако множество регуляторных белков может также соединяться с неидентичными партнерами, образуя гетеродимеры, состоящие из двух различных субъединиц. Поскольку гетеродимеры обычно образуются из двух белков, которые отличаются по специфичности связывания с ДНК, то смешение и сочетание регуляторных белков подобным образом значительно расширяет репертуар ДНК связывающих специфичностей, который могут показать эти белки. Как показано на рис. 7.20, три разные специфичности связывания с ДНК, в принципе, могут быть сформированы из двух типов мономеров «лейциновой молнии», тогда как шесть — из трех типов мономеров и т. д.
Рис.7.20.Гетеродимеризациябелков,содержащих«лейциновуюмолнию»,можетизменитьспеци-
фичность связывания с ДНК. Гомодимеры «лейциновой молнии» связываются с симметричными последовательностями ДНК, как это изображено слева и по центру. Эти два белка узнают различные последовательностиДНК,обозначенныекраснымииголубымиучасткаминаДНК.Дваразныхмономера могутобъединятьсяиобразовыватьгетеродимер,которыйузнаетужегибриднуюпоследовательность ДНК,состоящуюизодногокрасногоиодногоголубогоучастка.
Однако при таком беспорядочном сочетании белков действуют и ограничения. Например, если бы в обычной эукариотической клетке все типы белков с «лейциновой молнией» образовывали гетеродимеры, то количество «взаимных помех» между цепями, регулирующими экспрессию генов в клетке, было бы, вероятно, настолько огромным, что вызвало бы хаос. Возможность образования определенного гетеродимера зависит от того, как хорошо гидрофобные поверхности двух «лейциновых молний» сцепляются друг с другом, что, в свою очередь, зависит от конкретных аминокислотных последовательностей двух областей этих «застежек». Таким образом, в клетке каждый белок, содержащий «лейциновую молнию», может образовывать димеры только с небольшим набором других белков с аналогичным мотивом.
Гетеродимеризация является примером комбинаторного контроля (combinatorial control), при котором клеточным процессом управляют не отдельные белки, а комбинации различных белков. Гетеродимеризация как механизм комбинаторного контроля экспрессии генов встречается у многих различных видов регуляторных белков (рис. 7.21). Комбинаторный контроль является ведущей темой, с которой мы будем неоднократно сталкиваться в этой главе, а образование гетеродимерных комплексов, регулирующих активность генов, является только одним из множества путей, при котором белки, чтобы контролировать экспрессию генов, действуют совместно.
Определенные комбинации регуляторных белков стали «намертво» связанными в клетке; например, два разных ДНК-связывающихся домена могут посредством
654 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 7.21. Гетеродимер, состоящий из двух гомеодоменных белков, связанный со своим участком распознаванияДНК.Желтаяспираль4правогобелка(Matα2)неструктурированавотсутствиелевого белка (Mata1) и образует спираль только при гетеродимеризации. Последовательность ДНК распозна- етсясовместнообоимибелками;некоторыеизконтактовбелок–ДНК,образованныхMatα2,показаны нарис.7.13.Дваэтихбелкаявляютсябелкамипочкующихсядрожжей,укоторыхгетеродимеропределяет специфическийтипклеток(см.рис.7.65).Спиралипронумерованывсоответствиисрис.7.13.(Адапти-
рованоизT. Lietal.,Science270:262–269,1995.СразрешенияAAAS.)
перегруппировки генов, происходящей в ходе эволюции, оказаться соединенными в одну полипептидную цепочку, которая проявляет уже новую ДНК-связывающую специфичность (рис. 7.22).
7.2.12. Мотив спираль-петля-спираль тоже опосредует димеризацию и связывание с ДНК
Другим важным ДНК-связывающим мотивом, родственным «лейциновой молнии», является мотив спираль-петля-спираль (HLH; helix-loop-helix), который отличается от рассмотренного ранее мотива спираль-поворот-спираль и состоит из короткой α-спирали, соединенной при помощи петли со второй более длинной α-спиралью. Гибкость петли позволяет одной спирали загибаться назад и укладываться напротив другой. Как показано на рис. 7.23, подобная двуспиральная структура связывается и с ДНК, и с мотивом HLH второго белка. Второй белок может быть таким же (образуется гомодимер) или иным (образуется гетеродимер). В любом случае две α-спирали, которые отходят от области димеризационного контакта, образуют специфические контакты с ДНК.
У некоторых белков с мотивом HLH нет α-спирального удлинения, ответственного за связывания с ДНК. Эти укороченные белки могут образовывать гетеродимеры с белками нормальной длины, содержащими мотив HLH, но такие гетеродимеры не способны прочно связываться с ДНК, потому что образуют только половину необходимых контактов с ней. Таким образом, кроме создания активных димеров, гетеродимеризация является широко используемым клетками способом держать под контролем специфические регуляторные белки
(рис. 7.24).
Глава 7. Контроль генной экспрессии 655
Рис.7.22.ДваДНК-связывающихдоме- на, ковалентно соединенные гибким полипептидом. Приведенная структу-
ра (называемая Pou-доменом) состоит из гомеодомена и структуры спираль- поворот-спираль,соединенныхгибким
полипептидным «поводком», обозначенным пунктирными линиями. Единственный ген кодирует целиком весь белок, который синтезируется как непрерывнаяполипептиднаяцепь.Ковалентноесоединениедвухэтихструктур
подобным образом приводит к значительному увеличению сродства белка к специфической последовательности ДНКпосравнениюсосродствомлюбой отдельной части. Группа регуляторных
белков млекопитающих, примером которых является эта структура, регу-
лирует образование факторов роста, иммуноглобулинов и других молекул, участвующих в развитии организма. Конкретный приведенный пример относится к белку Oct1. (Адаптировано из J. D. Klemm et al.,Cell77:21–32,1994.СразрешенияElsevier.)
7.2.13. До сих пор невозможно предсказать последовательности ДНК, распознаваемые всеми регуляторными белками
Различные рассмотренные нами ДНК-связывающие мотивы белков представляют собой только структурные каркасы, от которых отходят специфические боковые цепи аминокислот и контактируют со специфическими парами оснований ДНК. Поэтому справедливо задать вопрос, существует ли простой код распознавания «аминокислота – пара оснований»; всегда ли, например, с парой оснований G-C контактирует определенная боковая цепь аминокислоты? Ответ будет отрицательным, хотя определенные типы взаимодействий аминокислота–основание встречаются намного чаще, чем другие (рис. 7.25). Как мы видели в главе 3, белковые поверхности практически любой формы и состава могут быть созданы всего лишь из 20 аминокислот, и регуляторный белок использует разные их комбинации, чтобы
Рис.7.23.Димермотиваспираль-петля- спираль (HLH), связанный с ДНК. Два мономера удерживаются вместе в узле изчетырехспиралей:каждыймономер предоставляет по две α-спирали, связанные гибкой петлей белка (красная). Соспецифическойпоследовательностью ДНКсвязываютсядвеα-спирали,высту- пающие из четырехспирального узла. (Адаптировано из A. R. Ferre-D’Amare et al., Nature 363: 38–45, 1993. С разрешенияMacmillanPublishersLtd.)
656 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.7.24.ИнгибиторнаярегуляцияусеченнымиHLH-белками.Мотивспираль-петля-спираль(HLH)отвечает за димеризацию и за связывание с ДНК. Слева гомодимер HLH-белков узнает симметричную последова- тельностьДНК.СправаприсвязыванииHLH-белканормальнойдлины(голубой)сусеченнымHLH-белком (зеленый), у которого нет LYR-связывающей α-спирали, образуется гетеродимер, который не способен прочносвязыватьсясДНК.Есливклеткеприсутствуетизбытокусеченногобелка,тоегомолекулыблокируют гомодимеризациюбелканормальнойдлиныи,следовательно,мешаютемусвязыватьсясДНК.
создать поверхность, которая будет строго комплементарна специфической последовательности ДНК. Известно, что одна и та же пара оснований, таким образом, может распознаваться множеством способов в зависимости от ее контекста (рис. 7.26).
Тем не менее постижение принципов узнавания белок–ДНК молекулярными биологами достигло такого уровня, что они могут конструировать новые белки, которые распознают
заданную последовательность ДНК.
Обозначив основные черты регулятор-
ных белков, давайте обратимся к некоторым методам, которые сейчас используются для их изучения.
7.2.14. По сдвигу электрофоретической подвижности ДНК можно выявить сайт-специфические ДНКсвязывающие белки
Генетические исследования, которые проложили дорогу к регуляторным белкам бакте-
Рис. 7.25. Один из самых распространенных типов вза-
имодействий белок–ДНК. Благодаря специфической геометрии акцепторов водородной связи (см. рис. 7.7) боковая цепь аргинина однозначно распознает гуанин. На рис. 7.9 показан еще один часто встречающийся тип взаимодействийбелок–ДНК.
Глава 7. Контроль генной экспрессии 657
Рис. 7.26. Обобщенная схема сайт-специфических взаимодействий между шестью разными «цинковыми пальцами» и последовательностями ДНК, которые они распознают. Все шесть «цинковых пальцев»имеютодинаковуюобщуюструктуру(см.рис.7.14),нокаждыйизнихсвязываетсясразличной последовательностьюДНК.Пронумерованныеаминокислотыобразуютα-спираль,котораяузнаетДНК (рис.7.14и7.15),атеаминокислоты,которыеобразуютсайт-специфическиеконтактысДНК,окрашены зеленым цветом. Нуклеотидные основания, с которыми контактирует белок, выделены оранжевым. Обычно образуются контакты аргинин–гуанин (см. рис. 7.25), но гуанин может также распознаваться серином, гистидином или лизином, как показано на рисунке. Кроме того, одна и та же аминокислота (в данном примере серин) может распознавать более одного основания. Два из изображенных «цинковыхпальцев»входятвсоставбелкаTTK(белокдрозофилы,участвующийвразвитииорганизма);два «пальца»принадлежатбелкумыши(Zif268),представленномунарис.7.15,идва—белкучеловека(GL1), аберрантные формы которого могут вызывать определенные типы рака. (Адаптировано из C. Branden andJ. Tooze,IntroductiontoProteinStructure,2nded.NewYork:GarlandPublishing,1999.)
рий, дрожжей и дрозофилы, намного сложнее у позвоночных. Поэтому для выделения регуляторных белков позвоночных потребовалось дождаться развития новых методов исследования. Многие из этих подходов основаны на определении в клеточном экстракте ДНК-связывающего белка, который специфически узнает известную последовательность ДНК, контролирующую экспрессию определенного гена. Один из самых обычных способов определения и изучения сайт-специфических связывающихся
