препараты_микра[1]

Диагностикумы представляют собой взвесь инактивированных микроорганизмов, их частей или метаболитов, несущих антигенную нагрузку.

Получение бактерийных диагностикумов

Для приготовления бактерийных диагностикумов используют производственные штаммы бактерий, обладающие полноценными антигенными свойствами. Штамм микро-

организма засевается в жидкую или на плотную питательную среду и инкубируется в термостате при 37˚С в течение 18-20 ч. Полученные после культивирования взвеси бакте-

рии подвергают инактивации различными методами, выбор которых зависит от свойств микроорганизма.

В настоящее время для инактивации используют прогревание, обработку формали-

ном, ацетоном, спиртом, мертиолятом и другими химическими веществами.

Инактивированную взвесь микробов разводят до требуемой концентрации, а затем разливают в ампулы или флаконы. Ряд диагностикумов готовят в сухом виде, что обеспе-

чивает их большую стабильность и длительность хранения. Каждая серия готового препа-

рата проверяется на стерильность, активность, специфичность, агглютинабельность с го-

мологичной эталонной агглютинирующей сывороткой. Готовые диагностикумы, как пра-

вило, содержат от 3 до 50 млрд. микробных тел в 1 мл.

В ряде случаев для серологической диагностики применяют не корпускулярные ди-

агностикумы (приготовленные из цельных микробных клеток), а специфические антиге-

ны, выделенные из клеток. Бактериальная клетка представляет собой комплекс антигенов.

Антигенными свойствами обладают жгутики (Н-антигены), капсула (К-антигены), кле-

точная стенка, (О-антигены), цитоплазматическая мембрана и другие компоненты клетки.

Для установления более точной специфичности антител в сыворотке больного приготав-

ливают специфические монодиагностикумы. Так, при брюшном тифе для определения групповых О-антител и видовых Н-антител применяются соответствующие О- и Н-

диагностикумы.

Принцип получения таких препаратов состоит в извлечении из микробной клетки специфических антигенов различными методами: многократным замораживанием с по-

следующим оттаиванием, кипячением, действием ультразвука, спирта, соляной кислоты,

фракционированием на сефадексах и т.д.

Для этой цели сертифицированный штамм определенного вида бактерий выращива-

ют на питательной среде при 37˚С. Через сутки биомассу освобождают от примесей пита-

тельной среды путем центрифугирования или фильтрации, хромотографии, а затем экст-

рагируют при низкой температуре десятикратным количеством 0,25 N раствора трихлоро-

221

уксусной кислоты. Экстракт нейтрализуют углекислой содой до рН 7,0 и диализуют в те-

чение 2 сут в проточной водопроводной воде и в течение 1 сут – в дистиллированной во-

де. Обессоленный экстракт осаждают четырьмя объемами ацетона, растворяют в дистил-

лированной воде и вторично осаждают ацетоном. Полученный осадок антигена промыва-

ют спиртом и эфиром, и после контроля и стандартизации разливают в ампулы, высуши-

вают и применяют в серологических реакциях агглютинации, преципитации, связывания комплемента и др. Изготовление бактерийных антигенов основано на том принципе, что выделенные из микробной клетки наиболее иммунологические активные субстанции, ос-

вобождаемые от балластных веществ клетки, являются более специфичными по сравне-

нию с корпускулярными диагностикумами.

Приготовление эритроцетарных диагностикумов

В серологических исследованиях достаточно широко применяется реакция непрямой

(пассивной) гемагглютинации, для постановки которой необходим эритроцитарный диаг-

ностикум. Реакция непрямой гемагглютинации используется в двух вариантах: для опре-

деления антигена или определения антител в сыворотке больного.

Принцип приготовления эритроцитарных диагностикумов заключается в адсорбции на поверхности обработанных эритроцитов антигена или антитела. Для получения эрит-

роцитов используется кровь человека О (1) группы, животных (барана, обезьяны, морской свинки), птиц (петуха, гуся). Кровь собирают в стерильную посуду со стеклянными буса-

ми и дефибринируют путем встряхивания в течение 10-15 мин и затем смешивают с рав-

ным объемом антикоагулянта. В качестве последнего используют 2,5% раствор цитрата натрия. Взвесь эритроцитов обрабатывается раствором танина в изотоническом растворе хлориде натрия (1:20000) для увеличения способности поверхности эритроцитов к ад-

сорбции крупномолекулярных антигенов. Антигенами в реакции непрямой гемагглютина-

ции могут служить очищенные антигены соответствующих микробов, экстракты бактери-

альных клеток т.д.

Антигены разводят фосфатно-буферным раствором (рН 7,2) и адсорбируют на обра-

ботанных эритроцитах. Проводят соответсвующие контроли на специфичность, актив-

ность, стерильность, стандартизируют и разливают в ампулы.

Преимущество эритроцитарных диагностикумов, перед описанными выше бактери-

альными заключается в их стабильности, высокой чувствительности, специфичности.

Реакция непрямой гемагглютинации может быть использована и для выявления спе-

цифического антигена из материала больных. С этой целью к танизированным эритроци-

222

там добавляют антитела (иммуную сыворотку или γ-глобулин) к определенному виду микроорганизма.

В данном случае эритроцитарный диагностикум обозначают как «антительный».

Основные методы получения вирусных диагностикумов.

Для диагностики вирусных инфекций широко применяются различные серологиче-

ские тесты, из которых важное место занимают реакции преципитации, торможения ге-

магглютинации, нейтрализации, связывания комплемента, иммунофлюресценции и др.

Для постановки последних используют диагностикумы, приготовленные из органов животных, куриных эмбрионов, культур тканей, в которых репродуцировали конкретные вирусы. Насколько многообразны методы культивирования вирусов, настолько же разно-

образны способы приготовления диагностикумов. При получении препаратов из органов животных используют мозг, печень, легкие, в которых происходит наибольшее накопле-

ние вируса. Так, для постановки РСК при ряде нейровирусных инфекций применяются диагностикумы, приготовленные из мозга мышей и сирийских хомяков, зараженных соот-

ветствующим вирусом.

Однако, такие препараты содержат много балластных веществ и для освобождения от них пользуются различными методами очистки. На ранних этапах приготовления ди-

агностикумов проводят очистку вирусной суспензии мозга путем термолизиса с после-

дующим центрифугированием.

Для изготовления диагностикума для РСК при клещевом энцефалите предложен способ очистки вируссодержащей суспензии мозга белых мышей при помощи термолизи-

са, с последующим очищением от балластных белков метиловым и этиловым спиртом, β-

пропиолактоном.

Для освобождения антигенов от белков и фосфолипидов используют метод очистки фреоном-113 (диагностикум для РСК при Коксаки группы А вирусной инфекции) прота-

минсульфатом, эфиром, сухим бентонитом для многих других вирусов. Очень часто для освобождения вирусных суспензий от мозговой ткани используют фильтрацию через фильтрационные пластины с различной пористостью.

Для приготовления ряда диагностикумов с успехом применяют куриные эмбрионы,

которые заражают соответствующим вирусом в аллантоисную жидкость (вирус гриппа), в

хорионаллантоисную оболочку (вирус осповакцины). Как и мозговые диагностикумы, для препаратов полученных на КЭ, также требуется применение ряда методов очистки и кон-

центрации от балластных веществ. С этой целью применяли диализ, адсорбцию вируса на

223

эритроцитах, центрифугирование, фильтрацию, осаждение, хроматографическое разделе-

ние. Степень очистки от балластных веществ должна достигать 95-98%.

В настоящее время для приготовления больших количеств диагностикума применя-

ется метод тканевых культур. На культуре клеток почек овечьего эмбриона, фиброблла-

стов эмбриона курицы получены препараты для диагностики вирусов клещевого и япон-

ского энцефалитов, для РСК и РПГА.

На культуре клеток фиброблластов эмбриона курицы получены комплементсвязы-

вающий и гемагглютинирующий диагностикум венесуэльского энцефаломиэлите лоша-

дей, западного и восточного энцефаломиэлита, Синдбис, Чикуньгунья, парагриппозных вирусов.

Диагностикумы, приготовленные на культуре клеток, хотя и уступают по активности препаратам, полученным на животных, но простота приготовления их на культуре ткани заставляет проводить исследование по изысканию путей повышения их активности. С

этой целью используют различные методы концентрации.

Для получения диагностикумов вирусов клещевого энцефалита, омской геморраги-

ческой лихорадки, шотландского энцефалита и других применяли концентрирование ме-

тодом выпаривания в чашках Петри, в целлофановых мешках с последующим центрифу-

гированием.

Для диагностики ветряной оспы используют культуральный диагностикум, приго-

товленный на культуре клеток фибробластов легкого человека, обработанной ультразву-

ком с последующим центрифугированием.

Для очистки и концентрации многих вирусов применяются полимеры, мембранные фильтры.

Таким образом, при большом разнообразии технологий получения вирусных диагно-

стикумов, принцип их получения сводится к следующим этапам:

1.Наличие сертифицированного штамма вируса, из которого будет готовиться ди-

агностикум.

2.Получение вирусной суспензии (биомассы) на культуре клеток, зараженных жи-

вотных, куриных эмбрионах.

3.Выделение вируса, очистка и концентрация.

4.Инактивация вируса температурой, химическими и физическими методами.

5.Контроль препарата на стерильность, специфичность и активность.

6.Стандартизация диагностикума, ампулирование, лиофильное высушивание, за-

пайка и этикетировка.

Срок хранения препаратов – 1 год и более.

224

Приготовление риккетссиозных диагностикумов

Серологические методы диагностики риккетсиозов долгое время не могли быть ис-

пользованы вследствие трудности приготовления антигенов из риккетсий, которые не культивируются на искусственных питательных средах. В 1917-1920 гг. были заложены основы серологической диагностики сыпного тифа, где в сыворотках больных было обна-

ружено наличие комплементфиксирующих антител. В качестве антигена в этих исследо-

ваниях была использована риккетсиозная взвесь из зараженных вшей. Получение такого диагностикума очень трудоемко, что ограничивало его практическое применение. Позд-

нее был предложен метод накопления риккетсий Музера в брюшной полости крыс, облу-

ченных рентгеном.

Новый этап в приготовлении риккетсиозных антигенов начался с тех пор, когда были разработаны более совершенные методы культивирования и накопления риккетсий в ку-

риных эмбрионах, в агаро-тканевых средах, в легких мышей.

Риккетсиозные антигены могут применяться в виде корпускулярных, растворенных или растворенно – корпускулярных антигенов.

Для приготовления корпускулярных диагностикумов используют легочно-

риккетсиозный материал и культуру риккетсий получаемых на куриных эмбрионах.

Принцип изготовления препаратов из легких мышей, зараженных риккетсиями, и яичных культур заключается в применении нескольких модификаций:

1.Освобождение риккетсиозных взвесей от тканевых и белковых элементов мето-

дом эфирной обработки.

2.Дифференцированное центрифугирование с последующей дополнительной очи-

сткой от посторонних белков методом коагуляции.

Техника приготовления корпускулярных диагностикумов из легких зараженных мышей сводится к следующему.

Ткань легких зараженных мышей тщательно измельчается путем растирания с квар-

цевым песком с добавлением физиологического раствора. Затем производится центрифу-

гирование в течение 5-10 мин при 1500-2000 об/мин для удаления грубых частиц. Надоса-

дочная жидкость отсасывается и подвергается длительному центрифугированию при большом числе оборотов для осаждения риккетсий. К осадку, содержащему риккетсии,

добавляется консервант 0,5% фенола и 5% фосфатного буферного раствора с рН 7,4. По-

лученная взвесь разливается в большие пробирки и оставляются на 48 ч при комнатной температуре, после чего жидкость над осадком отсасывается, еще раз центрифугируется для осаждения риккетсий и к осадку добавляется 0,25% фенола и 5% фосфатного буфера.

225

Концентрация риккетсий устанавливается по оптическому бактерийному стандарту

(500 млн – 1 млрд микробных тел в 1 см3).

Приготовление корпускулярных антигенов из легочной ткани мышей ограничивается двумя видами риккетсий – R prowaseki и R mooseri, так как только эти виды дают обиль-

ное размножение в легких зараженных мышей.

Для приготовления диагностикумов для всех видов риккетсий используются кури-

ные эмбрионы.

Желточные мешки зараженных куриных эмбрионов, содержащие огромное количе-

ство риккетсий, измельчаются и добавляется 0,4% формалина и 5% фосфатного буфера.

Через 2 сут взвесь подвергается центрифугированию. Надосадочную жидкость снова цен-

трифугируют длительное время и полученный осадок разводят физиологическим раство-

ром и подвергают пятикратной обработке эфиром. После пятой эфирной обработки вод-

ная фaза, содержащая риккетсии, освобождается от эфира и к ней добавляется консервант

– 0,25% фенола или формалина (0,2%).

Концентрация риккетсий в готовом препарате устанавливается по оптическому бак-

терийному стандарту (500 млн или 1 млрд микробных тел в 1 см3).

Корпускулярные диагностикумы из риккетсий могут применяться как для реакции агглютинации, так и для реакции связывания комплемента, и обеспечивают хорошую се-

рологическую дифференциацию риккетсий.

Наряду с этими методами, предложен ряд более сложных способов приготовления концентрированных и очищенных растворенных антигенов.

Благодаря возможности приготовления указанных диагностикумов появилась воз-

можность применения серологических реакций для исследования и диагностики заболе-

ваний, вызванных риккетсиями.

Выпускаются препараты в ампулах в сухом виде.

3.3. Диагностические сыворотки

Агглютинирующие сыворотки

Для идентификации микроорганизмов широко применяется реакция агглютинации – склеивание микробов и скучивание их под влиянием специфических антител – агглюти-

нинов, содержащихся в иммунной сыворотке. В лабораторной практике применяются ди-

агностические агглютинирующие сыворотки, которые готовят путем иммунизации жи-

вотных соответствующими микроорганизмами или их антигенами.

226

В качестве продуцентов агглютинирующих сывороток используют кроликов, бара-

нов, коз, ослов, лошадей. Наиболее удачной моделью для получения иммунных сывороток являются кролики.

Для иммунизации животных применяют живые или убитые микроорганизмы, типич-

ные по морфологическим, культуральным, биохимическим, серологическим и антигенным свойствам. Иммунизацию проводят путем многократного введения антигена с постоянно увеличивающей дозой. Для получения полноценных диагностических сывороток проводят

3-4 инъекции с интервалом в 5 сут. На 5-7 сут после последней иммунизации берется про-

ба крови и проверяется титр антител в сыворотке животного. Если титр антител достаточ-

но высок, то проводится кровопускание. Полученную кровь освобождают от форменных элементов и к сыворотке добавляют консервант – 0,5% хлороформа и выдерживают не менее 1 мес при температуре 4-8˚С для стабилизации титра. После выдержки определяют окончательный титр специфичных антител к специфическим антигенам в реакции агглю-

тинации с набором соответствующих живых микроорганизмов.

Диагностические сыворотки выпускаются в двух видах: неадсорбированные и адсор-

бированные агглютинирующие сыворотки. Специфические адсорбированные сыворотки получают путем удаления неспецифических и групповых антител из нативных сывороток методом адсорбции (метод Кастелани).

В качестве адсорбента применяются живые и убитые микроорганизмы, имеющие близкое родство с культурой, примененной для иммунизации животных. Истощаемая сы-

воротка после каждой адсорбции проверяется в реакции агглютинации на стекле как с кмикроорганизмами того вида, которым ведется истощение так и с микроорганизмами,

реагировавшими с ней при первоначальном контроле, а также с гомологичными микроор-

ганизмами.

Для освобождения адсорбированных сывороток от микробных тел проводится цен-

трифугирование или фильтрация через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и после выдерживания сыворотки при комнатной температуре в течение 48 ч проверяется на стерильность, специфичность и активность. Применение адсорбированных сывороток да-

ет возможность определения выделенного микроба в пределах вида или типа при помощи реакции агглютинации на стекле без дополнительной постановки развернутой реакции агглютинации.

Диагностические сыворотки разливаются в ампулы по 1 мл запаиваются и могут хранится в течение 1 года. Для более длительного хранения сыворотки выпускают в вы-

сушенном состоянии по 1 мл в ампуле.

227

Диагностические преципитирующие сыворотки

Преципитирующие сыворотки применяются для постановки реакции преципитации с целью диагностики инфекционных заболеваний.

Реакция преципитации характеризуется высокой чувствительностью и специфично-

стью позволяет обнаружить наличие антигена в очень малых концентрациях.

Преципитирующие сыворотки получают путем многократной иммунизации лабора-

торных животных живыми или убитыми микроорганизмами, а также их антигенами.

Сыворотки для преципитации готовят с очень высокими титрами, не ниже 1:100 000.

Высокое накопление антител в крови у животного достигается более длительной иммуни-

зацией соответствующим антигеном. На первом этапе иммунизации вводят небольшие дозы (0,5 мл) антигена в течение 2-3 нед по 3 сут подряд с перерывами в 4 сут. Для полу-

чения сывороток с высокими титрами антигены вводят в дозе 1-3 мл с интервалом 4-6 сут от 8 до 16 раз. Иногда применяют комбинированный метод иммунизации, при котором один цикл проводят внутривенно, а второй подкожно или внутрибрюшинно в зависимо-

сти от природы антигена.

После пробного кровопускания на 7-12 сут после последнего введения антигена про-

водится основное кровопускание для получения сыворотки.

Кровь освобождается путем центрифугирования от форменных элементов и консер-

вируется 0,5% хлороформа или 1-2% борной кислоты.

Готовый препарат контролируют на специфичноть, стерильность, активность и раз-

ливают в ампулы в жидком виде или высушивают под вакуумом.

Получение люминесцирующих сывороток

Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии используется для ин-

дикации и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний с помощью реакции иммунофлюоресценции. Люминесцентный метод обладает высокой чувствительностью,

специфичностью и позволяет проводить экспресс диагностику. Для применения указанно-

го метода используют люминесцирующие сыворотки, которые готовят из специфических иммунных сывороток, полученных из крови животных иммунизированных соответст-

вующими антигенами. Схема иммунизации животных, последующая обработка сыворотки подобна технологии получения агглютинирующих сывороток с последующим выделени-

ем глобулиновой фракции различными методами осаждения. Полученные глобулины об-

рабатывают флюрохромами, например, изоцианатом флюоресциина в соотношении 3 мг красителя на 100 г белка. При наличии в исследуемом материале соответствующего спе-

228

цифического антигена (микроорганизма) люминистирующие сыворотки образуют ком-

плексы АГ-АТ, хорошо видимых под люминисцентным микроскопом.

3.4. Получение и использование иммуноферментных тест-систем

для определения антигенов и антител

Иммуноферментный анализ (ИФА) относится к методам, основанным на примене-

нии меченных антигенов и антител и широко используется в практической медицине с це-

лью идентификации как инфекционных, так и не инфекционных антигенов и для опреде-

ления количества и динамики нарастания иммуноглобулинов различных классов (антител)

в сыворотке крови. В настоящее время существует множество иммуноферментных тест-

систем, которые выпускают предприятия биотехнологической промышленности.

Принцип метода ИФА заключается в обнаружении антигена (или антитела), фикси-

рованного на определённом носителе, специфическими иммуноглобулинами, соединён-

ными (конъюгированными) с ферментами, чаще других для метки используют пероксида-

зу или щелочную фосфатазу. После соединения антигена с меченной ферментом иммун-

ной сывороткой в смесь добавляют субстрат и индикатор. Освободившийся фермент рас-

щепляет субстрат, реакционная смесь окрашивается в желто-коричневый цвет, если в ка-

честве субстрата для пероксидазы используется перекись водорода или в желто-зелёный,

если метка осуществлялась щелочной фосфотазой. Наиболее распространён твёрдофазный иммуноферментный метод. На твёрдом носителе, например, в лунках в лунках планшетов из полистерола, сорбируют антиген. В лунки с адсорбированным антигеном добавляют сыворотку крови больного, а затем антиглобулиновую сыворотку (содержащую антитела против иммуноглобулинов человека), меченную ферментом, и субстрат для фермента с индикатором. При положительном результате изменяется цвет раствора. Твёрдофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. В этом вариан-

те в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную,

меченную ферментом, сыворотку против антигена, затем субстрат для фермента и краси-

тель. Результат реакции можно оценивать визуально и инструментально с помощью фо-

тометрических методов.

Кроме описанного выше прямого метода ИФА используется непрямой вариант реак-

ции, который включает обработку антигена антивидовыми антителами, меченными фер-

ментом, против иммуноглобулинов животных, при иммунизации которых получены АТ к инфекционным антигенам. Для определения АГ эта модификация ИФА даёт возможность применять не антимикробные меченые сыворотки, а антивидовые, что расширяет возмож229

ность поиска антигенов. Далее приведены примеры иммуноферментных тест-систем для определения специфических противовирусных иммуноглобулинов (антител) и бактери-

ального антигена.

Векто – ВКЭ – IgM – стрип (тест-система D-1152)

Характеристика и назначение тест-системы. Диагностическая иммуноферментная тест-система «Векто-ВКЭ-IgM-стрип» представляет собой набор реагентов для выявле-

ния иммуноглобулинов класса М к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) методом имму-

ноферментного анализа (ИФА). Один набор рассчитан на проведение 96 анализов, вклю-

чая контроли. Для исследования небольшой партии проб возможны 12 независимых по-

становок ИФА по 8 анализов каждая, включая контроли. Комплектуется всеми необходи-

мыми для ИФА реагентами. Тест-система предназначена для выявления иммуноглобули-

нов класса М к ВКЭ в сыворотке (плазме) крови человека, и может быть использована в клинических и эпидемиологических исследованиях для диагностики клещевого энцефали-

та.

Состав набора. В состав набора для проведения ИФА входят следующие ингредиен-

ты:

планшет разборный с иммобилизованными антителами к IgM человека;

положительный контрольный образец инактивированный (К+);

отрицательный контрольный образец инактивированный (К-);

раствор для предварительного разведения сывороток;

раствор для разведения сывороток (РРС);

антиген ВКЭ (сухой);

стабилизирующий раствор для разведения антигена ВКЭ;

конъюгат (моноклональные антитела к ВКЭ, меченные пероксидазой хрена);

раствор для разведения конъюгата (РРК);

концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином (ФСБ-Т-25);

цитратно-фосфатный буферный раствор с перикисью водорода ЦФР);

тетраметилбензидин (ТМБ), концентрат;

стоп-реагент;

плёнка липкая.

Приготовление анализируемых образцов. Для проведения ИФА не рекомендуется использовать гемолизированные, гиперлипидные или повторно замороженные свыоротки.

230