Sivolob_A_V__Afanasyeva_K_S_Molekulyarna_organ

251

кінетохорів до мікротрубочок веретена поділу. Для перевірки коректності такого приєднання необхідна координація роботи великої кількості білків – елементів контрольної системи. Частина цих елементів виконує роль сенсорів (білки, які здатні "відчувати" дефекти у приєднанні мікротрубочок до кінетохору), інша частина – роль ефекторів (білки, що здатні у випадку дефектів затримати клітину на стадії метафази, залишаючи сестринські хроматиди з'єднаними в центромерних ділянках).

Отже, можна виділити три найважливіші аспекти, що мають головне значення для успішного та коректного розходження хромосом по дочірніх клітинах: хромосоми мають бути компактизованими, щоб забезпечити швидке переміщення великої маси ДНК; дочірні хромосоми повинні зберігати зв'язок між собою від моменту реплікації ДНК до початку розходження; у чітко визначеному місці на кожній хромосомі має сформуватись основний інструмент розходження – кінетохор, який повинен коректно приєднатись до машинерії розходження – веретена поділу. Надкомпактизація мітотичних хромосом розглянута в попередньому розділі, а в цьому описано сучасні уявлення щодо інших аспектів сегрегації хромосом.

Нагадаємо, що в процесі компактизації хромосом у профазі відбувається описана у підпідрозд. 6.1.5 дисоціація когезинових комплексів з плечей хромосом (так званий профазний шлях дисоціації). У результаті сестринські хроматиди залишаються з'єднаними між собою лише в ділянці центромери, що надає їм характерної Х- або V-подібної форми. Дисоціація когезинових комплексів з центромер забезпечується іншим механізмом, ніж профазний шлях. Відбувається така дисоціація (і розділення сестринських хроматид по центромерним ділянкам) під час анафази і лише за умови коректного приєднання мікротрубочок до кінетохорів.

7.1. Структура центромери

Центромера як видима в світловий мікроскоп первинна перетяжка мітотичних хромосом була вперше описана

252

Вальтером Флемінгом (Walther Flemming) у 1880 році. Через декілька десятків років було встановлено, що ця ділянка є необхідною для нормального розділення хромосом між клітинами у процесі їх поділу. На сьогодні послідовності ДНК, що формують центромеру, та білки, які з ними взаємодіють, описані для багатьох організмів. Проте, до сих пір в літературі немає єдиної загальноприйнятої дефініції терміну “ центромера”. Розбіжності полягають у тому, що одні автори визначають центромеру як ділянку ДНК, де розміщені характерні центромерні послідовності, другі включають до складу центромери і гетерохроматинові блоки, які фланкують центромерний район, треті вважають центромерою лише ділянку хроматину, яка має у складі нуклеосом особливий варіант гістона Н3 – CenH3 ( підпідрозд. 2.1.3), що він є платформою для рекрутування білків кінетохору. Ми скористаємось цим останнім підходом і під центромерою будемо розуміти, головним чином, хроматинову ділянку, яка містить CenH3-нуклеосоми і є достатньою для формування повноцінного кінетохору.

7.1.1. Центромерна ДНК у більшості організмів представлена досить довгою ділянкою, розмір якої коливається в межах від 10 тис. пар основ у дріжджів Schizosaccharomyces pombe до декількох сотень тис. пар основ у ссавців. Такі центромери називають регіональними. Крім того, існують два особливі випадки: центромерна ділянка у дріжджів Saccharomyces cerevisiae складає 125 пар основ і містить всього одну нуклеосому – така центромера називається точковою; у нематод та деяких видів раків центромери є дифузними – здатність формувати кінетохор (основна властивість центромерної ділянки) притаманна практично всій хромосоми

(рис. 7.1).

253

Мікротрубочки

Рис. 7.1. Схематичне зображення трьох типів центромерних ділянок.

Точкова центромера S. cerevisiae складається з трьох елементів послідовності (рис. 7.2): CDE I, CDE II та CDE III (centromere DNA element). Послідовність CDE I, яка фланкує центральний домен CDE II з 5'-кінця центромери, – найкоротша (10 пар основ). Не зважаючи на консервативність CDE I, повна делеція цього елементу не впливає на функціонування центромерного району. Домен CDE III (25 пар основ) фланкує CDE II з 3'-кінця центромери. Цей елемент є також консервативним, спостерігається високий ступінь гомології CDE III між усіма 16 хромосомами S. cerevisiae (рис. 7.2). Мутаційний аналіз послідовностей CDE III окремих хромосом показав, що навіть заміна одного нуклеотиду призводить до повної дисфункції центромери. Центральний елемент – CDE II – довжиною 76–85 пар основ є найменш консервативним з трьох центромерних елементів. Головна його ознака – збагаченість на АТ-пари (більше 90 %), причому зменшення їх вмісту суттєво порушує сегрегацію хромосом. На ділянці ДНК довжиною 125 пар нуклеотидів (основною частиною якої є зазначені три елементи послідовності) формується одна нуклеосома, яка містить замість канонічного гістона Н3 його варіант Cse4 (назва CenH3 у S. cerevisiae). Кожний елемент CDE взаємодіє також із специфічними білковими комплексами, що створюють функціональний кінетохор.

Рис. 7.2. Нуклеотидні послідовності центромер 16 хромосом

(CEN1–16) S. cerevisiae (за даними Saccharomyces Genome Database, www.yeastgenome.org). Позначено елементи CDE I–III.

Довжина центромерної ділянки у дріжджів, що діляться

(Schizosaccharomyces pombe), коливається від 10 до 40 тис. пар основ. Її теж розділяють на декілька блоків послідовностей (рис. 7.3). Центральна частина – кор (позначається як cnt) – має розмір 4–5 тис. пар основ і містить неповторювальні послідовності ДНК. Кор фланкований ідентичними інвертованим повторами (imr), в межах яких знаходяться гени тРНК. Обидва елементи – cnt і imr – є АТ-збагаченими та містять крім звичайних нуклеосом нуклеосоми з білком Cnp1 (CenH3 у S. pombe). За внутрішніми інвертованими повторами

255

розташовані так звані зовнішні повтори (otr), які входять до складу прицентромерного хроматину і формують канонічні нуклеосоми.

Центромерна ділянка ДНК дрозофіли (Drosophila melanogaster), довжиною 420 тис. пар основ, організована у вигляді мікросателітних послідовностей, що тандемно повторюються. Мікросателітні повтори розділені в багатьох місцях вставленими в цю зону ретротранспозонами та ділянками послідовності, що не повторюються (рис.7.3). Послідовності повторів представлені двома типами довжиною по п'ять пар основ, які є дуже консервативними: ААТАТ та СТСТТ. Варіабельність послідовності сателіту ААТАА складає 2 %, а сателіту СТСТТ – всього 0,3 %. Аналіз послідовностей ретротранспозонів в центромерах дрозофіли виявив низьку їх варіабельність. Припускають, що інсерція цих мобільних елементів в дану ділянку відбулася недавно в процесі еволюції геному Drosophila. Як і у дріжджів, центромерний хроматин D. melanogaster також збагачений CenH3 (позначається як білок

CID).

256

otr imr cnt imrotr S. pombe

тандемний повтор довжиною 171 пар основ

Рис. 7.3. Організація центромерних районів хромосом різних видів організмів.

Улюдини (та у більшості досліджених ссавців) так само, як і

удрозофіли, ДНК центромерної ділянки організована у вигляді тандемних повторів так званої α-сателітної ДНК, довжина повтору становить 171 пару основ (рис.7.3). Центромерна ділянка може містити більше 20 тис. таких повторів (загальна довжина ділянки коливається від 0,1 до 4 млн. пар основ). Середня варіабельність послідовностей α-сателітних повторів є меншою 2 %. Проте, високий консерватизм нуклеотидних послідовностей спостерігається лише в центральній частині

257

центромерної ділянки. По мірі віддалення від центру дивергенція поступово зростає і сягає 30 % на фланкуючих ділянках довжиною по 40 тис. пар основ. Ця закономірність може мати відношення до механізму встановлення центромери (наступний підпідрозділ): делеційний аналіз центромерних сателітних послідовностей людини виявив, що для створення кінетохору необхідною є невелика центральна ділянка розміром приблизно 500 тис. пар основ. Саме в цій області поряд зі звичайними нуклеосомами наявні нуклеосоми з білком CENP-A (так називається білок CenH3 у ссавців).

Незважаючи на різноманітність центромерних послідовностей як за довжиною, так і за нуклеотидним складом, вони мають ряд спільних рис. По-перше, всі вони містять АТзбагачені ділянки і майже не містять активних генів. По-друге, в усіх регіональних центромерах присутні елементи послідовності, що тандемно повторюються багато разів. Потретє, центромерні ділянки ДНК завжди фланковані гетерохроматиновими прицентромерними районами.

7.1.2. Механізм визначення центромери та структура центромерного хроматину. Класифікація хромосом за їх морфологією, наприклад, при каріотипуванні, базується на двох основних моментах: на розмірі хромосом та розміщенні центромери відносно кінців (відповідно до нього хромосоми розділяють на акроцентричні, метацентричні та субметацентричні). Очевидно, що показники, обрані базисом опису видоспецифічного набору хромосом, повинні бути інваріантними в усіх клітинах організму та майже ідентичними в усіх представників даного виду (слово “ майже” враховує поліморфізм хромосом). Дійсно, Х-хромосома людини в нормі є субметацентричною, а Y-хромосома – акроцентричною, і це притаманне без виключення будь-яким клітинам людського організму та відтворюється від поділу до поділу.

Постає питання, яким чином ділянка ДНК, що є центромерою, незмінно упізнається як місце утворення кінетохору на хромосомі? Перша відповідь, яка спадає на думку, полягає в тому, що центромеру визначає центромерна ДНК,

258

тобто описані у попередньому підрозділі особливості її організації. Певна роль центромерної ДНК у визначенні центромери не виключена, але вона не може бути ключовою. По-перше, розмаїття центромерних ДНК різних організмів за довжиною та нуклеотидними послідовностями є несумісним з універсальністю механізмів сегрегації хромосом при клітинному поділі. По-друге, численні експерименти вказують на те, що центромерна ДНК зазвичай (за виключенням точкової центромери S. cerevisiae) практично не містить (або містить дуже мало) сайтів взаємодії з кінетохорними білками.

Не зважаючи на різноманітність центромерних послідовностей ДНК різних організмів, хроматин в цій ділянці має універсальну спільну рису: частина нуклеосом містить замість гістона Н3 його варіант CenH3. Вважається, що саме присутність CenH3 є необхідною і достатньою для визначення центромери як такої і, відповідно, для утворення кінетохору. На користь провідної ролі CenH3 у якості платформи для збірки кінетохору свідчить феномен утворення центромер у ділянках, в нормі для цього не призначених. В численних експериментах була показана здатність АТ-збагачених послідовностей ДНК, які до того не мали функції центромери, формувати повноцінний кінетохор. Така центромера, утворена de novo, називається неоцентромерою. Її поява можлива лише при умові порушення функціонування “ старої” центромери або на ацентричних фрагментах хромосом, утворених внаслідок хромосомних аберацій (рис. 7.4). В обох випадках спостерігається акумулювання CenH3 в ділянці неоцентромери з подальшим утворенням там кінетохору.

259

Рис. 7.4. Схема появи неоцентромери після утворення ацентричного фрагмента хромосоми. (а) – нативна хромосома з функціональним кінетохором, (б) – хромосомний розрив після дії пошкоджуючого чинника, (в) – утворення неоцентромери на ацентричному фрагменті.

Нуклеосоми, що містять CenH3, присутні тільки в ділянці центромери і ніколи не спостерігаються в інших районах хромосом (за виключенням неоцентромер). При цьому пошук в центромері нуклеотидних послідовностей, які могли б слугувати сайтами впізнання CenH3, не дав результату: жоден елемент послідовності не здатен специфічно упізнаватися цим білком. Яким же чином CenH3 завантажується саме в нуклеосоми центромер? Очевидно, що таке завантаження вимагає спеціальних механізмів. Зокрема, важливу роль виконує специфічний для CenH3 елемент його амінокислотної послідовності. Докази цього були отримані в експериментах з химерним гістоном Н3, сконструйованим рекомбінантними методами. Цей білок містив у межах гістонового фолду (в ділянці петлі L1 та спіралі α2) 15-ти амінокислотну послідовність CATD (CENP-A targeting domain), характерну для білка CENP-A і відсутню у канонічного гістона Н3. Виявилося, що нуклеосоми з химерним гістоном Н3CATD успішно акумулюються в центромерній ділянці і створюють повноцінний кінетохор.

260

Інкорпорація новосинтезованого CenH3 в центромеру, на відміну від інших варіантів Н3, що завантажуються у хроматин під час реплікації (Н3.1, Н3.2) або в процесі транскрипції в інтерфазі (Н3.3), відбувається під час телофази чи на початку G1-фази клітинного циклу. Доставка димера CenH3-Н4, як і канонічного димера Н3-Н4, забезпечується гістоновими шаперонами. У ссавців за це відповідає специфічний гістоновий шаперон HJURP (Holliday Junction Recognition Protein), який впізнає CATD-домен CenH3. Проте, у обох видів дріжджів та у дрозофіли не було виявлено специфічних для CenH3-Н4 шаперонів: доставку забезпечує фактор збірки нуклеосом RbAp48 – компонент шаперонового комплексу CAF-1 (який здійснює завантаження димерів Н3– Н4 при реплікації, підрозділ 5.6) та деяких інших мультибілкових комплексів. Як вже зазначалося, особливістю збірки CenH3-нуклеосом є те, що вона не залежить від реплікації ДНК, а відбувається при виході клітини з мітозу. Очевидно, що після S-фази в центромерній ділянці залишається вдвічі менше CenH3-нуклеосом. Існує припущення, що під час реплікації, їх "нестачу" компенсують нуклеосоми із звичайними гістонами Н3-Н4 і роль шаперонів зводиться до заміни одного гістонового комплексу на інший, щоб забезпечити, таким чином, утворення кінетохору в наступному клітинному циклі. Цілком можливо також, що після S-фази в центромерній ділянці залишаються проміжки, які потім заповнюються нуклеосомами, що містять CenH3.

Впізнанню центромери комплексами шаперонів та димерів CenH3-Н4 у більшості організмів передує зв’язування з нею білка Knl-2 (рис.7.5), мутація в гені якого призводить до порушення у локалізації CenH3-нуклеосом і, відповідно, до аномальної сегрегації хромосом. Детальний механізм впізнання центромери білком Knl-2 залишається недостатньо зрозумілим, але до складу білка входить так званий Myb-домен (структурний мотив білків, який забезпечує впізнання коротких нуклеотидних послідовностей). Це дозволяє припустити, що Knl-2 здатен специфічно взаємодіяти з невеликим повторюваним елементом центромери. У ссавців білок Knl-2 взаємодіє з центромерною ділянкою у складі мультибілкового комплексу Mis 18 (рис.7.5).