Биохимия растений

шествует 3′-концевой последовательности поли-А и во время синтеза является специфическим сигналом к полиаденилир˝ованию 3′-конца мРНК.

Íà 3′-концах мРНК гистоновых генов выявлена последователь-

ность нуклеотидных остатков, которая содержит комплемен˝тарные повторы, способные образовывать терминаторную шпиль˝ку

подобно тому, как это происходит при терминации транскрип˝ции

у бактерий.

Синтез РНК является первым этапом реализации в организме˝

генетической информации, который далее инициирует синте˝з

белков и прежде всего белков-ферментов, катализирующих ту˝ или иную жизненно важную биохимическую реакцию. Если в конк-

ретных физиологических условиях потребности в данном фе˝р-

менте нет, то и нет необходимости организму осуществлять ˝синтез соответствующей мРНК. Поэтому синтез многих мРНК в

клетках организмов подвержен регуляции, которая осущест˝вля-

ется как на стадии инициации транскрипции, так и в процесс˝е транскрипции.

На стадии инициации транскрипции регуляторное воздейст˝вие

оказывают специфические белки, которые, присоединяясь к о˝п- ределенным участкам ДНК, останавливают или, наоборот, акт˝и-

вируют действие фермента РНК-полимеразы. Белки-регулятор˝ы,

подавляющие действие РНК-полимеразы, называют репрессорами,

а усиливающие действие этого фермента — активаторами транскрипции. Участок ДНК, с которым связывается белок-регулятор,

у бактерий называют оператором, у высших организмов — регуляторным элементом гена. Способность регуляторных белков связываться с ДНК зависит от низкомолекулярных веществ — эффекторов. Эффекторы, соединяясь с регуляторными белками, вызывают аллостерическое изменение их структуры, вследс˝твие

чего изменяется сродство белка-регулятора к регуляторно˝му уча-

ñòêó ÄÍÊ.

Различают два вида белков — репрессоров транскрипции. О˝дни

из них оказывают репрессирующее действие на промоторы в от-

сутствие эффектора, а при взаимодействии с эффектором тер˝яют сродство к своему регуляторному участку и таким образом и˝ни-

циируют процесс транскрипции. Белки-репрессоры второго т˝ипа

способны присоединяться к ДНК и ингибировать транскрипц˝ию только в комплексе с эффектором. В отсутствие эффектора б˝е- лок-репрессор неактивен, и в таких условиях РНК-полимераза может взаимодействовать с промотором и осуществлять син˝тез мРНК.

Наиболее эффективный механизм репрессии транскрипции реализуется в том случае, когда участок связывания белка-˝репрес-

501

сора находится на промоторе. Присоединившись к определен˝ному участку промотора, репрессорный белок препятствует пр˝исое-

динению к промотору РНК-полимеразы. Действие белков — ак-

тиваторов транскрипции — очень часто заключается в том, что такой белок присоединяется к регуляторному участку ДНК, непосредственно прилегающему к промотору, и, взаимодей-

ствуя с РНК-полимеразой, переводит этот фермент в активное

состояние.

Впервые принципы регуляции транскрипции бактериальных

генов были сформулированы в 1961 г. Ф. Жакобом и Ж. Моно на

основе изучения системы регуляции в клетках Å. coli синтеза фермента β-галактозидазы, катализирующего гидролитическое рас-

щепление лактозы до глюкозы и галактозы. Синтез этого фер˝мен-

та происходит, когда в питательной среде нет глюкозы, но пр˝и- сутствует лактоза. Кроме гена, кодирующего β-галактозидазу, в

состав лактозного оперона входят также ген пермеазы, обеспечи-

вающий транспорт лактозы в бактериальную клетку, и ген ти˝огалактозидтрансацетилазы, не участвующей в усвоении клетк˝ой

лактозы. Все три гена копируются в виде одного мРНК-транс-

крипта.

В отсутствие лактозы транскрипция лактозного оперона по˝дав-

лена белком-репрессором, который связывается с операторо˝м, на-

ходящимся рядом с промотором, и препятствует РНК-полимера˝зе начать синтез мРНК β-галактозидазы и других ферментных бел-

ков данного оперона. Структура белка-репрессора кодирует˝ся

специальным геном. Репрессор образует с операторным учас˝тком (длиной 24 нуклеотидных остатка) достаточно прочный компле˝кс,

и для поддержания его в устойчивом состоянии достаточно 1˝0 молекул репрессорного белка в расчете на одну клетку.

При появлении в питательной среде лактозы она частично превращается в свой изомер аллолактозу, которая служит эф˝фектором, образующим комплекс с белком-репрессором, переводя˝ его в неактивное состояние по отношению к оператору. В так˝ом состоянии он уже не препятствует РНК-полимеразе связыват˝ься с промотором и начинать транскрипцию, образуя мРНК β-галак- тозидазы и пермеазы. Далее уже с участием мРНК осуществля˝ется синтез указанных ферментных белков. Под действием эффе˝к- тора синтез ферментов возрастает примерно в 1000 раз и подде˝р- живается на таком уровне, пока в питательной среде содерж˝ится

лактоза.

Молекула белка-репрессора лактозного оперона построена˝ из

четырех идентичных полипептидных цепей, каждая из которы˝х включает 360 аминокислотных остатков. Во взаимодействии с

ДНК участвуют N-концевые фрагменты полипептидных цепей,

502

формирующие биспиральные элементы, которые структурно с˝о- вместимы с бороздками двойной спирали ДНК.

При снижении концентрации лактозы в питательной среде бе˝-

лок-репрессор снова присоединяется к оператору и останав˝ливает транскрипцию лактозного оперона, а все синтезированные м˝олекулы мРНК быстро расщепляются под действием рибонуклеаз˝ы

до нуклеотидов. Как было указано ранее, время полужизни мР˝НК

у прокариот составляет несколько минут.

Лактозный оперон Å. coli также контролируется другим регуля-

торным белком — активатором катаболитных оперонов (БАК˝), ко-

торый функционирует совместно с циклическим АМФ (цАМФ), и его действие зависит от концентрации в питательной среде˝ опти-

мального источника углерода для бактерий — глюкозы. В пр˝исут-

ствии глюкозы концентрация цАМФ понижается, а в ее отсутствие — повышается. Молекула БАК состоит из двух идентичных

полипептидов, каждый из которых построен из 209 аминокис-

лотных остатков. Во взаимодействии с ДНК участвуют С-конце- вые фрагменты этого белка, а N-концевые последовательност˝и

аминокислотных остатков БАК связывают цАМФ. При этом взаи˝-

модействие БАК с ДНК возможно только после присоединения˝ цАМФ.

Комплекс БАК с цАМФ присоединяется к своему оператору,

который непосредственно прилегает к промоторному участ˝ку. Под воздействием БАК инициируется связывание с промотор˝ом

РНК-полимеразы, катализирующей далее синтез мРНК β-галак-

тозидазы и пермеазы. Однако такой синтез возможен только ˝в том случае, когда под действием лактозы инактивирован белок-р˝еп-

рессор. Таким образом, активная транскрипция лактозного о˝перона бактерий происходит при снижении в питательной среде к˝онцентарции глюкозы, повышающей концентрацию цАМФ, и при наличии достаточного количества лактозы. Образующийся ц˝АМФ активирует БАК, который связывается со своим оператором и˝ инициирует действие фермента РНК-полимеразы, а лактоза, п˝ревращаясь в аллолактозу, инактивирует белок-репрессор, под˝авляющий транскрипцию генов лактозного оперона. Схематическ˝и функционирование лактозного оперона E. coli представлено на рисунке 12.9.

Таким образом, в регуляции транскрипции лактозного оперо˝на бактерий участвуют регуляторные белки — белок-репрессо˝р и

БАК, которые кодируются генами, образующими свои опероны,˝ и

транскрипция этих оперонов управляется системой регуля˝ции,

включающей определенные белки.

К системе регуляции транскрипции относятся также термин˝а-

торы, находящиеся не в конце оперонов, а в их начале между п˝ро-

503

Рис. 12.9. Активация и репрессия транскрипции генов лактозно˝го оперонаE. ñoli под воздействием регуляторных белков

мотором и нуклеотидным остатком, с которого начинается тр˝анс-

крипция структурных генов, или даже внутри структурных ге˝нов,

кодирующих белковые полипептиды. После прохождения РНК-

полимеразой нуклеотидной последовательности такого тер˝мина-

тора в синтезирующейся цепи РНК может образовываться тер˝минаторная или антитерминаторная шпилька. Если возникает т˝ер-

минаторная шпилька, синтез РНК прекращается, если антитер˝ми-

наторная — терминация транскрипции не происходит и син˝тез

РНК продолжается.

Наиболее хорошо функционирование регуляторных термина-˝ торов изучено в составе бактериальных оперонов, кодирующ˝их

ферменты биосинтеза различных аминокислот. В регуляции э˝тих терминаторов участвуют рибосомы, осуществляющие синтез˝ ферментных белков на синтезирующейся цепи мРНК. В начале цеп˝и РНК до инициаторного нуклеотида, начинающего транскрипц˝ию первого структурного гена, находится нуклеотидная после˝дова-

тельность, кодирующая в составе пептидной цепи несколько˝ ами-

нокислотных остатков той аминокислоты, которую синтезир˝уют ферменты, образующиеся под контролем данного оперона. При˝ недостатке аминокислоты в бактериальной клетке рибосом˝а в ходе синтеза ферментного белка задерживается на кодонах˝ этой

аминокислоты, содержащихся в начале цепи мРНК, и стеричес˝ки

препятствует образованию терминаторной шпильки, давая, о˝днако, возможность возникновению антитерминаторной шпильк˝и. В таких условиях РНК-полимераза в процессе синтеза мРНК про˝хо-

дит терминаторную последовательность без осуществления˝ терми-

нации.

Однако, если концентрация аминокислоты достигает макси-

мального уровня, рибосома быстро проходит начальный учас˝ток

504

цепи мРНК, содержащий несколько кодонов данной аминокисл˝о-

ты, и не препятствует образованию терминаторной шпильки, ˝ко-

торая останавливает синтез мРНК, и в соответствии с уже из˝вест-

ным нам механизмом происходит репрессия синтеза фермент˝ов,

ответственных за образование указанной аминокислоты. Функционирование регуляторных терминаторов может зави-˝

сеть от концентрации в клетке нуклеозидтрифосфатов. При н˝из-

кой концентрации одного из видов нуклеозидтрифосфатов у˝же в начале синтеза цепи мРНК замедляется движение РНК-полиме˝- разы, вследствие чего рибосома, осуществляющая синтез ферментного полипептида на данной мРНК, догоняет РНК-полиме-˝ разу на участке, занимаемом терминаторной последователь˝ностью нуклеотидов, и препятствует образованию терминаторн˝ой

шпильки, в результате терминация не происходит. Если же в клетке содержится много нуклеозидтрифосфатов, паузы в хо˝де транскрипции не возникает и рибосома не препятствует образованию терминаторной шпильки, вследствие чего синтез мРНК пр˝е- кращается.

У высших организмов регуляция транскрипции генов включа˝ет дополнительные регуляторные последовательности, которы˝е локализованы в промоторах, в составе нуклеотидных последов˝ательностей между промотором и структурным геном, а также внутри

структурных генов в составе интронов — участков ДНК, не к˝одирующих полипептиды. К указанным регуляторным последовательностям присоединяются специфические белки, которые˝, взаимодействуя с РНК-полимеразой, активируют действие этого˝ фермента или, наоборот, прекращают транскрипцию.

Âтранскриптонах высших организмов структурная организ˝а- ция промоторов значительно сложнее. Транскрипция генов, к˝атализируемая РНК-полимеразой II, начинается на ДНК с инициаторной последовательности нуклеотидных остатков ТЦ(А,Г)˝А. Этому участку на расстоянии 40—120 н. о. предшествует ТАТА-

последовательность. Кроме того, в промоторной зоне обычно˝ на-

ходятся повторяющиеся элементы так называемых активиру˝ющих последовательностей (АП), к которым присоединяются регул˝я- торные белки, инициирующие действие фермента РНК-полиме- разы II. При этом общая длина промоторной зоны может состав-˝ лять 200—300 н. о.

Âпромоторах генов, кодирующих конститутивные ферменты, встречаются повторы нуклеотидной последовательности ГГ˝ГЦГГ,

àв промоторах многих тканеспецифических генов — нукле˝отидная последовательность ЦЦААТ. Некоторые активирующие по˝-

следовательности в структуре ДНК способны оказывать сво˝е вли-

505

яние на значительном расстоянии (более 1000 н. о.), причем они могут находиться как на 5′-конце, так и 3′-конце значащей цепи ДНК. Такие регуляторные последовательности ДНК получили˝ название энхансеров (усилителей транскрипции).

Транскриптоны генов рибосомальных РНК имеют свои особенности функционирования. Многократно повторяющиеся н˝ук-

леотидные последовательности этих генов локализованы в ядрышке, и их транскрипцию катализирует фермент РНК-полимераза I.

Гены рРНК разделены некодирующими участками — спейсера˝ми,

в которых содержатся повторяющиеся последовательности ˝нукле-

отидов, активирующие транскрипцию. В конце спейсера наход˝ит-

ся терминаторная последовательность нуклеотидов, котор˝ая осуществляет терминацию транскрипции, но при этом РНК-полиме˝-

раза I не отделяется от ДНК. К ферменту присоединяется новая

регуляторная субъединица, и он продолжает транскрипцию с˝леду-

ющего участка гена рРНК.

Транскрипцию генов 5S-РНК и тРНК катализирует фермент РНК-полимераза III. Поскольку эти гены имеют небольшие нук-

леотидные последовательности, их промоторы не выделяютс˝я в

отдельные участки, а находятся непосредственно в структу˝ре ге-

нов. Инициация транскрипции осуществляется с помощью рег˝у-

ляторных белков, которые присоединяются к определенному˝ уча- стку ДНК в составе гена и активируют фермент РНК-полимера˝зу

III. Терминаторный участок таких генов включает несколько п˝о-

вторяющихся остатков тимидиловых нуклеотидов.

Синтезированные в ходе транскрипции молекулы всех видов˝

РНК подвергаются направленному воздействию ряда фермен˝тов, которые осуществляют превращение РНК-предшественников в функционально активные молекулы РНК, способные выполнят˝ь

свойственные им биологические функции. Превращение РНКтранскриптов в функционально активные молекулы РНК назы˝вается процессингом. В клетках высших организмов процессинг РНК происходит в ядре.

Образующиеся в ходе транскрипции ядерные предшественни˝-

ки мРНК связываются с ядерными белками, формируя рибонук-˝ леопротеидные комплексы, которые далее включаются в проц˝ессинг. Особенность процессинга у эукариот заключается в то˝м, что их мРНК-транскрипты состоят из участков, которые входят в˝ со-

став функционально активных (зрелых) мРНК, и участков, под˝ле-

жащих удалению в результате процессинга. Участки мРНК-тра˝нс- крипта, входящие в состав зрелых мРНК, называют экзонами, а удаляемые в ходе процессинга фрагменты мРНК-транскрипта˝ —

интронами. Таким образом, гены высших организмов представля-

ют собой определенную последовательность чередующихся ˝экзо-

нов и интронов (рис. 12.10).

506

Экзоны включают участки мРНК-транскриптов, кодирующие первичную структуру полипептидов, участки на 5′-конце, содер-

жащие нуклеотидные последовательности промоторов и при˝лега-

ющие к промоторам регуляторные последовательности, с кот˝орыми связываются регуляторные белки. Кроме того, в состав эк˝зонов входят участки на 3′-конце мРНК-транскрипта между терминато-

ром и поли-А последовательностью.

Интроны представляют собой участки мРНК-транскрипта, не кодирующие структуру белков, но они могут включать регуля˝тор-

ные последовательности, участвующие в регуляции транскр˝ип-

ции. Число интронов в составе эукариотических генов варьи˝рует от одного до нескольких десятков, и их общая длина может во˝

много раз превышать длину экзонов.

Каждый экзон в структуре гена кодирует определенный учас˝- ток в белковой молекуле длиной 40—50 аминокислотных остат-

ков, который представляет собой отдельный функциональны˝й

элемент третичной структуры полипептида (относительно а˝втономный участок белковой молекулы). Из таких элементов в це˝лом

и состоит белковая молекула. Если в двух разных белках сод˝ер-

жится одинаковая структура, то она кодируется одним и тем˝ же экзоном. Путем повторения и перекомбинации экзонов обесп˝ечи-

вается генетический механизм построения пространственн˝ой

структуры белков из небольших автономных единиц, предста˝вляющих собой отдельные самостоятельные элементы вторично˝й и

третичной структуры составляющих белки полипептидов.

В ходе процессинга происходит удаление из структуры мРНК˝- транскрипта с помощью ферментов интронов, а экзоны соедин˝я-

ются в определенной последовательности, образуя функцио˝наль-

РНК-транскрипт

Рис. 12.10. Схема образования зрелой мРНК из РНК-транскрипта:

Экз. 1, 2, 3, 4, 5 — экзоны в составе РНК-транскрипта; Инт. 1, 2, 3, 4 — ин˝троны в составе РНК-транскрипта; поли-А-нуклеотидная последовательность˝ на ′3-конце мРНК из повторяющихся остатков адениловой кислоты

507

но активную мРНК. Процесс соединения экзонов в функционал˝ь- но активную мРНК получил название сплайсинга. Процессинг и сплайсинг мРНК представляют собой единый процесс образо˝вания зрелых мРНК, способных участвовать в синтезе белков. Ак-

тивную роль в процессе сплайсинга выполняют специфическ˝ие ядерные белки, а также малые ядерные РНК, синтез которых, ка˝к

и мРНК, катализируют РНК-полимеразы II. Эти РНК содержат много остатков уридиловой кислоты и имеют длину от 90 до

140 í. î.

Последовательность нуклеотидных остатков в интроне нач˝и-

нается на 5′-конце динуклеотидом ГУ и заканчивается на 3′-êîí-

це — АГ. Процесс сплайсинга начинается с расщепления фосфодиэфирной связи в конце нуклеотидной последовательност˝и пер-

вого экзона с образованием на 3′-конце свободной гидроксильной

группы (3′-ÎÍ). Ïðè ýòîì íà 5′-конце интрона, следующего за эк-

зоном, остается фосфорилированный гуанозин (как указано ˝ра-

íåå, íà 5′-конце интрона находится последовательность из двух нуклеотидов — ГУ).

На следующем этапе 5′-фосфорилированный гуанозин взаимо-

действует с 2′-ОН одного из остатков адениловой кислоты на про-

тивоположном конце интрона, образуя кольцевую структуру˝. На

последнем этапе полинуклеотидный радикал первого экзон˝а, имеющий на 3′-конце свободный гидроксил (3′-ОН), замещает поли-

нуклеотидный радикал на 3′-конце интрона, соединяясь с

5′-фосфатом следующего экзона, а интрон в виде кольцевой

структуры высвобождается, образуя на 3′-конце свободный гидро-

êñèë (3′-ÎÍ).

Последовательность удаления интронов необязательно дол˝жна

соответствовать последовательности расположения их в с˝труктуре

508

гена. Реакции, в которых происходит замещение одного нукл˝еотидного радикала на другой без изменения числа фосфодиэф˝ирных связей, называют реакциями трансэтерификации.

Процессинг на 3′-конце мРНК-транскриптов включает узнава-

ние специфической эндонуклеазной терминаторной последо˝вательности ААУААА, находящейся на расстоянии 11—30 нуклео-

тидных остатков от 3′-конца функционально активной мРНК, и отщепление от этого конца той части мРНК-транскрипта, кото-

рая не входит в состав зрелой мРНК. После этого к 3'-концу

мРНК присоединяются остатки адениловой кислоты (до 100 та-

ких остатков).

Âбактериальных клетках бó льшая часть мРНК, синтезируемой

âходе транскрипции, не подвергается процессингу. Однако ˝син-

тез функционально активных молекул рРНК и тРНК включает

посттранскрипционные изменения, т. е. транскрипты рРНК и˝

тРНК бактерий проходят через механизм процессинга. Гены

рРНК и тРНК бактерий образуют единый оперон, после транскрипции которого синтезируется РНК-транскрипт, включающ˝ий

полирибонуклеотидные последовательности 23S-РНК, 16S-РНК,

5S-РНК, тРНК и соединяющие их участки РНК, которые в ходе

процессинга подвергаются расщеплению.

Под действием специфических нуклеаз (РНКаза III, РНКаза М и др.) из РНК-предшественника выщепляются и подвергаются м˝о-

дификации нуклеотидные последовательности 23S, 16S и 5S-рРНК

с образованием 5′-фосфатных и 3′-ОН концов.

Âклетках высших организмов 28S-, 18S- и 5S-РНК синтезиру-

ются в виде одного высокомолекулярного транскрипта, из ко˝торого они выщепляются в ходе процессинга. У некоторых органи˝змов (инфузории, дрожжи и др.) в составе транскрипта 28S-рРНК со-

держится интрон, удаляемый в результате процессинга и спл˝айсинга.

Образуемые в ядрах клеток высших организмов предшествен˝- ники тРНК содержат интрон, включающий последовательност˝ь из

14—16 нуклеотидных остатков, которые следуют через один нукле-

отидный остаток за 3'-концом антикодона. Молекула предшест˝венника расщепляется эндонуклеазой, а образующиеся полинук˝леотидные фрагменты экзонов фосфорилируются и соединяются фосфодиэфирной связью под действием специфической лигазы.

Выщепление из общего РНК-транскрипта биохимического

предшественника тРНК, включающего около 100 нуклеотидных остатков, катализирует фермент РНКаза III. Процессинг 5′-конца предшественника тРНК осуществляет фермент РНКаза Р, кото-

рый состоит из РНК-компонента длиной 100—400 нуклеотид-

ных остатков и белка с молекулярной массой 17 тыс. Роль белка

заключается в том, что он усиливает каталитическое действ˝ие

509

РНК-компонента. Процессинг 3′-конца тРНК-предшественника и образование одноцепочечной ЦЦА-последовательности ка˝тализирует фермент РНКаза D. После осуществления процессинга ˝и сплайсинга РНК-транскриптов образуются функционально а˝к-

тивные молекулы рРНК, тРНК и мРНК, которые транспортируются из ядра в цитоплазму клетки и участвуют там в процесс˝ах

синтеза белков.

12.6. СИНТЕЗ БЕЛКОВ

Синтез белков представляет собой биохимический механиз˝м

образования полипептидов, аминокислотные последователь˝ности

которых закодированы в виде последовательности кодонов˝ в со-

ответствующей мРНК. В процессе синтеза полипептидов кодоны и протеиногенные аминокислоты вступают в непосредствен˝ное

взаимодействие друг с другом. Роль посредников между ними˝ вы-

полняют тРНК и ферментные системы, катализирующие правил˝ь-

ное связывание аминокислот с соответствующими тРНК, а так˝же

образование способных к синтезу белков рибосом и связыва˝ние их с мРНК. Поскольку процесс синтеза белков включает перевод˝

генетической информации, закодированной в виде последов˝а-

тельности кодонов в молекулах мРНК, в последовательность˝ ами-

нокислотных остатков в белковых полипептидах, его называ˝ют

трансляцией.

Синтез полипептидов начинается с активирования аминоки˝с-

лот и их ковалентного связывания с соответствующими тРНК˝, ко-

торое катализируют ферменты аминоацил-òÐÍÊ-синтетазы. Äëÿ

каждой аминокислоты существует свой фермент, который с вы˝сокой точностью катализирует присоединение конкретной ам˝инокислоты к соответствующей тРНК. На первом этапе фермент к˝а- тализирует взаимодействие аминокислоты с АТФ, в результа˝те об-

разуется аденилат аминокислоты, содержащий макроэргиче˝скую

связь, и пирофосфат:

На следующем этапе осуществляется перенос радикала акти˝-

вированной аминокислоты на 3′-конец тРНК, имеющий последовательность из трех нуклеотидных остатков ЦЦА со свобо˝д-

íûì 3′-ОН. В ходе такой реакции происходит соединение макро-

эргической связью остатка аминокислоты с соответствующ˝ей

510