Основы токсикологии

4.2. Исследования в опытах на клетках млекопитающих

Первоначально считалось, что культуры клеток млекопитающих будут идеальным объектом для изучения мутагенной активности токсикантов. Однако в процессе работы, вскрылись обстоятельства поколебавшие эти представления. Прежде всего клетки многих тканей трудно культивировать, у многих из них практически отсутствует способность к клонированию, метаболическая активность клеток недостаточна. В настоящее время в исследованиях предпочтение отдают культурам клеток перевиваемых линий (например, овариальные клетки китайского хомячка, клетки мышиной лимфомы и т.д.). Однако чувствительность этих клеток к ксенобиотикам уже отличается от чувствительности клеток первичных тканевых культур.

Исследования по оценке мутагенности обычно проводят, изучая изменения резистентности клеток к: 8-азагуанину или 6-тиогуанину (определяется активностью гипоксантин-гуанин- фосфорибозилтрансферазы - ГГФРТ); бромдезоксиуридину или трифтортимидину (определяется активностью тимидинкиназы - ТК); оуабаину (определяется активностьюNa/К- АТФазы).

ГГФРТ регулирует инкорпорацию пуринов из среды в клетку. Мутация локуса ДНК, ответственного за синтез энзима, приводит к угнетению ферментативной активности, прекращению транспорта пуринов в клетку, в том числе и их токсичных аналогов. Мутировавшие клетки выживают в среде, содержащей аза- и тиогуанины.

ТК активирует транспорт пиримидинов. Мутация лкуса ДНК, ответственного за синтез ТК, делает клетку не чувствительной к токсическому действию токсичных аналогов пиримидина.

Оуабаин убивает клетки, взаимодействуя сNa/К-АТФазой. Мутация локуса, ответственного за синтез этого энзима изменяет его сродство к токсиканту, увеличивает резистентность клетки к яду.

Наиболее часто используется модель мутации ТК локуса в опытах с культурой клеток мышиной лимфомы (иногда с добавлением в инкубационную средуS-9 фракции гепатоцитов). После воздействия исследуемого токсиканта оценивается количество клеток, способных образовывать колонии в среде, содержащей бромдезоксиуридин.

В настоящее время описано множество других тест-объектов, на которых можно проводить подобные исследования.

4.3. Оценка индукции синтеза ДНК клетками млекопитающих

Принцип метода заключается в оценке интенсивности репаративных процессов, инициируемых химическим повреждением ДНК. В основе метода лежит авторадиографическое определение степени инкорпорации меченного тритием тимидина в ядра клеток, предварительно обработанных обследуемым веществом.

Исследования обычно выполняются на гепатоцитах взрослых крыс самцов, диспергированных в инкубационной среде с последующей спонтанной адгезией на стеклянные подложки. В качестве положительного контроля используют гепатоциты, обработанные веществами, вызывающими повреждение ДНК и стимулирующими процесс её репарации: афлатоксином В1 или 2-ацетиламинофлюореном; отрицательные контроли - гепатоциты не подвергавшиеся воздействию. Перед исследованием клетки на определенное время помещают в среду, содержащую обследуемый токсикант. Выбор концентрации вещества осуществляется в ходе предварительных опытов, путем определения кривой зависимости "доза-эффект" по показателю жизнеспособность клеток (окраска обработанных веществом клеток трипановым синим). После воздействия клетки отмывают и помещают в среду, содержащую тимидин, меченый тритием. После инкубации их высушивают, фиксируют и покрывают эмульсией для авторадиографического исследования. Спустя определенный экспозиционный период (обычно несколько недель) производят подсчет числа оптически плотных гранул над областью ядра клеток, отражающих степень инкорпорации тимидина. Поскольку гепатоциты обладают высокой способностью к репарации, чем выше степень инкорпорации тимидина, тем большее повреждение ДНК вызвал исследуемый агент.

Недостатком метода является то, что с его помощью невозможно оценить, приводит ли процесс репарации к формированию ошибок генетического кода (формируются ли мутации), то есть решить, является ли инициированное повреждение ДНК пагубным для клетки.

4.4. Исследование ковалентного связывания токсикантов

Поскольку многие мутагены способны образовывать ковалентные связи с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями молекул ДНК (аддукты ДНК), выявление аддуктов ДНК является прямым свидетельством генотоксичности ксенобиотика. Неинвазивные методы предполагают выявление аддуктов в моче животных, подвергшихсявоздействию токсикантов; инвазивные - выделение органов и тканей отравленных животных, экстракцию из гомогенатов тканей ДНК и нуклеотидов, с последующим их химическим (иммунохимическим) анализом.

4.5. Изучение хромосомных аберраций

Хромосомные аберрации, вызванные действием химических веществ, могут быть выявлены путем окрашивания клеток и последующего изучения с помощью обычного светового микроскопа. Для исследования могут использоваться культуры клеток (например, яичника китайского хомячка), обработанные изучаемым токсикантом по одной из схем, описанных выше, клетки костного мозга или лимфоциты периферической крови млекопитающих, которым токсикант вводилиin vivo. Виды выявляемых мутаций при этом включают: выпадение хроматидов, разрывы хромосом, делеции хромосом, появление хромосомных фрагментов, транслокации, полиплоидии.

Одним из широко используемых методов выявления генотоксичности является так называемый "микронуклеарный тест". Микроядра представляют собой фрагменты хромосом или целые хромосомы, не включенные в состав ядра, в ходе митотического деления клетки. Как правило, образование микроядер провоцируется веществами, вызывающими разрывы хромосом (кластогенные агенты) и токсикантами, повреждающими белки митотического веретена (см. выше). Токсиканты обычно вводят в дозах, составляющих 0,1 или 0,5 ЛД50. Контролем служит растворитель. У животных (как правило, мышей), подвергшихся действию химического вещества, после умерщвления, осуществляют забор косного мозга, окрашивают препарат и подвергают его микроскопии. Забор материала производят в течение определенного времени с интервалом 2 суток после прекращения (или на фоне продолжающегося) введения токсиканта. Количество клеток, содержащих микроядра, в препаратах костного мозга, полученных от животных разных групп, подсчитывают и сравнивают.

Повреждение герменативного эпителия (нарушения сперматогенеза) токсикантом может быть выявлено в опытах на крысах, мышах, хомячках. Самцам лабораторных животных изучаемый токсикант вводят в течение времени, необходимого для реализации полного цикла сперматогенеза, периодически (раз в неделю), спаривая их с самками разных групп. Самки умерщвляются спустя 2 недели после спаривания. Исследуются: состояние желтых тел яичников, соотношение живых и погибших эмбрионов. Конечными характеристиками оценки мутагенеза являются: индекс оплодотворяемости (отношение оплодотворенных самок к общему числу, спарившихся с самцами), преимплантационные потери (соотношение числа имплантировавшихся эмбрионов к числу желтых тел в яичниках),количество животных с мертвыми имплантатами относительно общего числа беременных самок, количество погибших имплантатов к общему количеству имплантатов.

Наследуемые мутации могут быть выявлены путем прямого исследования клеток потомства (на различных стадиях развития) самок или самцов, подвергшихся воздействию токсикантов.

Описание других, более сложных методов исследования, можно найти в специальной литературе.

ГЛАВА 6.3. ХИМИЧЕСКИЙ КАНЦЕРОГЕНЕЗ

Канцерогенами называются химические вещества, воздействие которых достоверно увеличивает частоту возникновения опухолей или сокращает период их развития у человека или животных.

Судьба этих веществ в организме, как и других ксенобиотиков, подчиняется общим законам токсикокинетики. Однако в действии на организм им присущ ряд особенностей. Так, развивающиеся под их влиянием эффекты носят отсроченный характер и являются следствием, как правило, длительного кумулятивного действия в малых дозах. Активность рассматриваемой группы веществ в отношении молекул - носителей наследственности в известной степени уникальна.

Первым, кто осознал возможность химической этиологии рака, был Percival Pott. В 1775 году им описан рак мошонки у ряда пациентов. Все они били трубочистами, что и натолкнуло доктора Pott на мысль, что длительный контакт кожи с сажей, может приводить к развитию рака. 100 лет спустя высокая частота рака кожи была выявлена у немецких рабочих, имевших длительный контакт с каменноугольной смолой - основным ингредиентом сажи. Позже было установлено, что веществами, содержащимися в смолах, и обладающими канцерогенной активностью, являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Характерные особенности строения этих соединений отражают структуры классических представителей группы: бензо(а)пирена и дибенз(а,h)антрацена (рисунок 1).

бнезо(а)пирен дибензо(а,h)антрацен

Рисунок 1. Типичные представители группы полициклических углеводородов

В 1935 году была доказана канцерогенная активность целого ряда азокрасителей. В 1937 году

вопытах на собаках удалось показать, что ароматические амины, и в частности 2-нафтиламин, способны вызывать опухоли мочевого пузыря. Высокая частота случаев этого новообразования у рабочих, контактировавших с некоторыми красителями, была показана ещё

в19 веке.

Следует различать понятия "канцерогенная активность" ("канцерогенность") и "канцерогенная опасность" вещества. Канцерогенная активность свидетельствует о способности вещества индуцировать развитие злокачественных новообразований, позволяет осуществлять сравнение веществ по этому признаку при непосредственном воздействии их на биологический объект. Канцерогенная опасность включает в себя дополнительные условия: распространенность вещества, возможность контакта с ним, его стабильность в окружающей среде или в местах потенциальных контактов и др.

1.Краткая характеристика канцерогенов

В настоящее время около 20 веществ, достаточно широко используемых в промышленности, отнесены к числу канцерогенов для человека (однако этот список постоянно увеличивается). Кроме того, убедительно доказано, что работа на целом ряде производств сопряжена с риском канцерогенеза, хотя конкретные причины (вещества), провоцирующие процесс не установлены. Это производства по синтезу аминов (рак мочевого пузыря), обработка изделий из хрома (рак лёгких), кадмия (рак простаты), никеля (рак слизистой полости носа и лёгких), резины (рак легких), гематитовые шахты (рак лёгких). Данные о смертности от новообразований, сопряженных с профессиональной деятельностью противоречивы. По оценкам специалистов США она может составлять от 5 до 20% всех смертей от рака в этой стране.

Бисхлорметиловый и хлорметиловый эфиры 1

Винилхлорид 1,2

Возгоны каменноугольных смол и пеков 1,2,3

Иприт сернистый 1

Каменноугольная и нефтяная смолы 1,3

Каменноугольный и нефтяной пеки 1,3

Минеральные масла неочищенные или не полностью очищенные 1,2 (используются для смазки, теплопередачи и т.п.)

Мышьяк и его неорганические соединения (триоксид, арсенат кальция, арсенит натрия, пентоксид, сульфид) 1,2,3

1-Нафтиламин технический, содержащий более 0,1% 2-нафтиламина1,2,3

2-Нафтиламин 1,2,3

Никель и его соединения (никеля оксид, гидроксид, карбонил, хлорид, субсульфид, карбонат, никелоцен, сульфид, хромфосфат)1

Смеси соединений никеля (файнштейн, никелевый концентрат и агломерат, оборотная пыль очистных устройств)1

Сланцевые масла 1,3

Тальк, содержащий асбестовые волокна 1

о-Толуидин 1,2,3

Хрома шестивалентного соединения (хроматы, бихроматы, оксиды, карбонил, фосфат, хлорид, ацетат, сульфат) 1

Эрионит 1

II. Лекарственные препараты и методы лечения:

Азатиоприн

Анальгетические смеси, содержащие фенацетин

Мелфалан

Комбинированная химиотерапия с использованием азотистого иприта, винкристина, прокарбазина, преднизолона и других алкилирующих агентов

Милеран

Треосульфан

Хлорамбуцил

1-(2-Хлорэтил)-3-(4-метилциклогексил)-1-нитрозомочевина

Циклофосфамид

Эстрогены стероидные (эстрадиол-17 и его эфиры, эстриол, эстрон, этинил эстрадиол, местранол, конъюгированные эстрогены)

Эстрогены нестероидные (диэтилстильбестрол, диеноэстрол, гексэстрол)

Эстрогенсодержащие контрацептивы орального применения

III. Производственные процессы, связанные с опасностью развития злокачественных новообразований у рабочих ***

Деревообрабатывающее и мебельное производство (машинная обработка древесины и мебельных заготовок в закрытых помещениях, фанерование)

Медеплавильное производство (плавильный передел, конверторный передел, огневое рафинирование)

Производство 1-нафтиламина, содержащего примесь 2-нафтиламина

Производство изопропилового спирта

Производство кокса, переработка каменноугольной, нефтяной и сланцевой смол, газификация угля

Производство резиновых изделий

Производство технического углерода

Производство угольных и графитовых изделий, производство анодных и подовых масс, а также предварительно обожженных анодов для электролизеров алюминия

Производство чугуна и стали (агломерационные фабрики, доменное и сталеплавильное производство, горячий прокат) и литье из них

Электролитическое производство алюминия с использованием самоспекающихся анодов, капитальный ремонт электролизеров

IV. Бытовые факторы:

Алкоголь

Табачный дым

Табачные продукты бездымные

Примечания: * - цифры означают основные пути поступления вещества или смесей веществ в организм: 1 - ингаляционный, 2 - пероральный, 3 - через кожу.

**- производство и применение запрещено.

***- помимо перечисленных к таким производствам относят также те, на которых имеется воздействие на человека веществ и продуктов, перечисленных в разделах I и II.

2.Классификации канцерогенов

Предложено классифицировать канцерогены по происхождению, химической структуре, степени участия в различных стадиях развития рака, по степени доказанности их канцерогенной активности и т.д.

1.Происхождение канцерогенов.

Природные канцерогены, это вещества, содержание которых в среде не зависит от деятельности человека. Их вклад в онкозаболеваемость считается незначительным. Так, установлено, что ежесуточно на поверхность Земли выседает около 170 т метеоритной пыли, в составе которой обнаруживаются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ).

На планете в настоящее время действует около 520 вулканов, их ежегодный выброс составляет 3-6 млрд. т химических веществ (аэрозоли, пепел, лава, газы). С пеплом в атмосферу может поступить до 12-24 т только одного бенз(а)пирена, не считая других ПАУ.

Обнаружены и описаны природные источники таких канцерогенов как мышьяк, асбест, афлатоксины, радионуклиды и др. Так, значительное число злокачественных новообразований кожи наблюдается на юго-западном побережье острова Тайвань, где население потребляет воду с высоким содержанием мышьяка - до 1,8 мг/л (ПДК в России - 0,05 мг/л).

Иногда канцерогены естественного происхождения могут накапливаться в организмах живых существ и растениях и по пищевым цепям попадать в организм человека (токсины синезеленых водорослей, афлатоксины).

Канцерогены антропогенного происхождения появились тогда, когда люди научились пользоваться огнем (около 500 тыс. лет назад). По-видимому, первыми искусственными канцерогенами были продукты пиролиза белков. Накопление канцерогенов в биосфере возрастало параллельно интенсификации промышленного производства. Процесс ускорился в последние десятилетия ХХ века. Например, производство бензола, вызывающего у людей лейкозы, составляет ежегодно 12 млн. т. Полихлорированных бифенилов произведено к настоящему времени 1,2 млн. т. Несмотря на запрещение выпуска и использования ПХБ их концентрация во всех средах биосферы и биообъектах не снижается. Суммарное поступление этих токсикантов в окружающую среду достигает 35% от произведенной массы. Из этого количества лишь 4% подвергается естественной деградации.

2.Химическая структура.

К канцерогенам относятся вещества, имеющие совершенно различное химическое строение (рисунок 2). Среди них ПАУ и гетероциклические соединения, ароматические азосоединения, ароматические аминосоединения, нитрозоамины и нитроамины, металлы, металлоиды и неорганические соли и др.

Рисунок 2. Структура некоторых канцерогенов, синтетических и естественного происхождения

3.Участие в различных стадиях развития рака (см. ниже).

4.Степень доказанности канцерогенной активности вещества.

Наиболее полный перечень веществ, исследованных на их канцерогенную активность, и соответственно их классификация принадлежит Международному Агентству Изучения Рака (МАИР, Лион, Франция). В нем представлены данные по более чем 800 соединениям. Список непрерывно пополняется.

Первая группа включает вещества, производственные или иные факторы, для которых имеются безусловные доказательства опасности возникновения опухолей у человека, то есть как минимум убедительные эпидемиологические данные (список веществ 1-й группы приведен выше). В эту группу вошло более 60 факторов, причем не только отдельные соединения, применяющиеся в быту, медицине, сельском хозяйстве, промышленности, но и сами производственные условия.

Вторая группа включает те факторы, которые "вероятно" (т.е. с высокой степенью доказанности) или "возможно" (с меньшей степенью доказанности) канцерогенны для человека. Эта группа делится на 2 подгруппы: 2А - 51 фактор (акрилонитрил, формальдегид,