Радіобіологія фул вершин (передмовалесс, вступлесс етс. едишн)

20

1) ферментативну, до якої відносяться сполуки, які володіють ферментативною активністю (супероксиддисмутаза, глутатіонпероксидаза, каталаза тощо); 2) неферментативну (каратиноїди, токофероли, аскорбінова кислота та інші); 3) низькомолекулярні речовини (глутатіон, карнозин, дофамін тощо).

Ключову роль в регуляції рівня АОС та, зокрема, супероксиду аніон-радикалу (О2-∙) у тканинах виконує фермент - супероксиддисмутаза (СОД). Виділено цілий ряд ізоферментів, які відрізняються особливостями структурної організації, наявності іонів металу, що входить до складу активного центру, та локалізацією у тканинах. Зокрема відомо три ізоензима СОД еукаріот (Cu,Zn-СOД, Mn-СОД та позаклітинна СОД), а також Fe-СОД, яка характерна переважно для прокаріот. Найбільший внесок в знешкодження (О2-∙) в організмі еукаріот належить Cu, Mn-СОД. Цей фермент є одним серед відомих антиоксидантних ферментів, що безпосередньо забезпечує обрив кисневозалежних вільнорадикальних реакцій в клітинах організму. Саме СОД здійснює рекомбінацію (О2-∙) з утворенням гідроген пероксиду:

[О2-∙] + [О2-∙] + 2Н+ 2Н2О2

Каталаза - антиоксидантний фермент, що приймає участь в утилізації гідроген пероксиду - продукту супероксиддисмутазної реакції. Вона каталізує наступну реакцію:

2Н2О2 2Н2О + О2 Каталаза в тваринних клітинах локалізована переважно в

пероксисомах. Відомо, що каталітична активність каталази особливо висока в клітинах печінки. Каталаза виступає синергістом СОД у клітині. Між активністю каталази і СОД виявлено високу ступінь кореляції. Вважається, що рівень активності внутрішньоклітинних ферментативних антиоксидантних систем генетично детермінований. Причому, накопичення в клітинах супероксидного аніон-радикала чи гідроген пероксиду супроводжується депресією ділянок геному, які відповідають за активність внутрішньоклітинних ферментативних антиокисних систем. У людини ген, який кодує синтез СОД, локалізовано у 21-й хромосомі.

Серед інших систем АО-захисту необхідно відмітити глутатіонзалежну АО-систему, яка включає три ферменти та центральний метаболіт цієї системи глутатіон (GSН).

Глутатіонредуктаза (ГР) – цитозольний фермент всіх еукаріотичних клітин, який здійснює відновлення глутатіону із його окисленої форми.

21

Глутатіонпероксидаза (ГПО) – каталізує процес відновлення високотоксичних гідропероксидів (ROOH) різноманітної будови в нетоксичні гідроксосполуки за рахунок відновленого глутатіону, який окислюється. Міститься в цитозолі та мітохондриальному матриксі .

Глутатіонтрансфераза (ГТ) – сімейство мультифункціональних ензимів, які використовують відновлений глутатіон для кон’югації зі сполуками як ендогенного, так екзогенного походження.

Глутатіон (GSН) – трипептид, який складається з L-глутамінової кислоти, L-цистеїну і гліцину. Він може існувати у двох формах – відновлений – GSH та окисленій (дисульфідглутатіон) – GSSG. Відновлення GSSG до GSH відбувається за участі глутатіонредуктази. Система GSH бере участь в окисно-відновних процесах, як головне джерело відновлювальних еквівалентів для регулювання окиснювання в межах клітини, його називають „головним відновником у клітині”. Концентрація глутатіону в клітині (1-10 ммоль/л) набагато перевищує рівень АФО та продуктів ПОЛ. За дії на організм екзогенних факторів різного походження концентрація GSН у клітині може суттєво змінюватись. Глутатіон включається в антиокислювальні захисні реакції буквальну в усіх частинах клітини - мітохондрії, ядрі, ендоплазматичному ретикулумі. Глутатіон належить до сімейства метаболітів (пептидів), які постійно присутні у клітині тварин та людини. До цього сімейства належать карнозин та його похідні, які метаболізуються в організмі людини та тварин. Вони характеризуються властивістю взаємодії із вільними радикалами з подальшою їх інактивацією.

Важлива роль у АО-захисті відводиться SH-вмісним сполукам, до яких окрім глутатиону відносяться цистеїн, цистин та метіонін. До захисних систем клітини відносяться і інші низькомолекулярні речовини, які здатні перехоплювати чи інактувати радикали, відновлювати АФО, у тому числі продукти ПОЛ (табл. 3.4). Слід відмітити, що значна кількість біологічно активних речовин використовується в якості препаратів – радіопротекторів.

Значна кількість речовин, які володіють АО-властивістю in vivo, не синтезуються в організмі, але необхідні для його функціонування. До таких речовин належать водота жиророзчинні вітаміни (табл.3.5), фенольні сполуки (пірокатехін, гідрохінон, флаваноли, кверцетин, катехіни, кумарини, флавоноїди,

Таблиця 3.4. Найбільш відомі антиоксиданти

22

перехоплювачами радикалів. На сьогодні відомо декілька тисяч фенольних сполук, серед яких значним антиокисним ефектом володіють вітаміни Е та К, убіхінони, триптофан та фенілаланін.

Значне біологічне значення для людини має антиоксидант -токоферол. Він жиророзчинний, локалізується, в основному, в гідрофобному шарі біомембран: 50% клітинного -токоферола локалізовано у ядрі, 30% - у мембранах мітохондрій, 20% - у мікросомальній мембрані. Недостача -токоферолу сприяє деструкції мембран.

До водорозчинних антиоксидантів відноситься аскорбат. Аскорбінова кислота може виступати в якості донора та акцептора іонів гідрогену завдяки наявності в структурі двох фенольних груп, її АО-властивості характеризуються широким спектром активуючої дії на вільні радикали. Однак, слід відмітити, що у присутності іонів Fe чи Cu аскорбінова кислота стає сильним прооксидантом. Антиокисні властивості аскорбінової кислоти пов’язані з її оксиредуктазними переходами. Втративши атом гідрогену, аскорбинова кислота перетворюється у радикал - монодегідроаскорбінову кислоту, який

23

проявляє прооксидантний ефект. Втрата ще одного атома гідрогену призводить до утворення дегідроаскорбінової кислоти. В цьому приймає участь фермент, який містить купрум - аскорбатоксидаза.

Значну групу складають мікроелементи та метали перемінної валентності, які приймають участь у окисно-відновних реакціях. Причому, шкідливим для клітини може бути як недостатня кількість цих елементів, так і їх надлишок.

Значним АО–захистом володіє селен та його сполуки. Селен – аналог сірки, але більш активний і витісняє сірку із її сполук. Групи –SеН володіють більш високою електрондонорною (і, відповідно, АО-) активністю, ніж –SН групи. У зв’язку із цим –SеН сполуки ефективно дезактивують вільні радикали, пероксиди, канцерогени. Селен стимулює перетворення метионіну в цистеін та синтез глутатіону. АОактивність селену викликає пильну увагу до цього мікроелемента, а саме, створення на його основі органічних сполук, які можна використовувати в якості лікарських препаратів.

Необхідно відмітити, що зміни активності антиоксидантних ферментів залежать від інтенсивності утворення активних форм оксигену (АФО): незначне зростання вмісту АФО призводить, як правило, до активації ферментної ланки антиоксидантної системи; значне зростання рівня вільних радикалів викликає пригнічення ферментної ланки радикального захисту клітин. Водночас, може зменшуватись пул і неферментних антиоксидантів, які виконують роль пастки вільних радикалів, перетворюючись в неактивні димерні та інші форми.

Постійний контроль, як ферментний, так і неферментний, за вмістом АФО, вільних радикалів тощо направлений на підтримку гомеостазу в клітині та організмі в цілому. Зрив такого контролю, що може виникнути в результаті екзогенного чи ендогенного впливу, призводить до інтенсифікації процесів ПОЛ, збільшенню концентрації та накопиченню в організмі продуктів ліпопероксидації, які володіють високою реакційною спроможністю та можуть чинити системну пошкоджуючу дію на клітину.

Показники, які визначають рівень вільнорадикальних процесів та стан антиоксидантної системи характеризують функціонування захисно-пристосувальних механізмів організму на клітинному рівні.

Таблиця 3.5. Деякі вітаміни та їх функції в організмі людини

Вітамін Активні форми вітамінів Специфічні функції вітамінів

25

РАДІАЦІЙНО – ІНДУКОВАНІ ПОРУШЕННЯ КЛІТИННИХ МЕМБРАН.

Клітинні мембрани, поряд із елементами цитоскелету, не тільки приймають участь у формуванні структурної організації клітин, а також виконують різноманітні функцій, зміни в яких можуть призвести до порушень життєдіяльності клітини в цілому і навіть до її загибелі. Ймовірне розподілення первинних іонізацій по ходу треків іонізованих частинок призводить до пошкодження мембранних структур, як в результаті безпосередньої іонізації мембранних молекул, так і опосередковано, внаслідок атаки вільних радикалів води та пероксидів.

В рамках загально визнаної рідинно-мозаїчної моделі, структура мембран (рис.3.14) розглядається з позицій динамічних властивостей та взаємозв’язку з мембранними функціями. Основні компоненти мембран – білки та ліпіди. Вуглеводи присутні у меншій кількості, в якості складових частин складних білків (глікопротеїнів) та складних ліпідів (гліколіпідів).

26

2

1

3

Рис.3.14. Схематичне зображення клітинної мембрани. 1 - мембранний бішар з вбудованими до нього білками, 2 – глікокалікс, 3

– цитоскелет

Глікокалікс. Наявність глікокаліксу характерно для зовнішніх мембран клітини. Він виконує ряд функцій, а саме: від нього залежать властивості клітинної поверхні, здатність клітин до фагоцитозу та адгезії з іншими клітинами. Структурні елементи глікокаліксу – глікопротеїни та мукополісахариди, в результаті опромінення піддаються дії вільних радикалів води, оскільки структурно орієнтований шар води безпосередньо підходить та проникає до елементів глікокаліксу.

Типова реакція глікокаліксу на дію іонізуючої радіації – часткове відшарування елементів глікокаліксу (шеддінг), які містять від’ємно заряджені вуглеводні та мукополісахаридні структури (сіалові та гіалуронові кислоти, хондроітинсульфат). Крім того, можлива нейтралізація зарядів поверхні клітини катіонами (кальцію, магнію тощо) і, як результат - змінюється її сумарний електричний заряд. Ці реакції не є специфічними та спостерігаються і за інших видів впливу. В результаті опромінення спостерігається, також, деструкція

27

структурних компонентів глікокаліксу, що, в свою чергу призводить до зростання проникності та доступу до мембрани води, електролітів, мікроорганізмів тощо. Поряд із цим, спостерігається ослаблення та зникнення цитоплазматичних „містків” між клітинами. Подібні зміни залежать від дози опромінення. Пошкодження глікокаліксу призводить, окрім іншого, і до зміни імунних властивостей клітинної поверхні.

Ліпіди. Кількісний та якісний склад ліпідів клітинних мембранних визначається їх функціональною активністю. До основних ліпідних компонентів мембран відносяться фосфоліпіди (основна доля),

сфінголіпіди, гліколіпіди та стероїди ( в мембранах тваринних клітин представлені холестеролом), якісний та кількісний вміст яких також має свої особливості для різних типів мембран. Фосфоліпіди – це складні етери фосфатидної кислоти. Основними фосфоліпідами (компонентами мембран) являются фосфатидилетаноламін,

фосфатидилхолін, фосфатидилсерин та фосфатидилінозит.

Загальновідомо, що фосфоліпіди – є найбільш радіочутливі компоненти клітинних мембран. Окисній атаці піддаються їх ненасичені жирнокислотні залишки.

Мембранні ліпіди утворюють бішарові структури, в яких реалізується два типи взаємодій: іонні взаємодії полярних „голівок” та гідрофобні – жирнокислотних ланцюгів. Ліпідний бішар клітинних мембран виконує дві основні функції – бар’єрну та матричну (структурну). Пошкодження бар’єру, в результаті порушенні щільності упаковки гідрофобних вуглеводних ланцюгів та зростання кількості структурних дефектів мембрани призводить до зростання її проникності для іонів та метаболітів і, як результат – до порушення регуляції внутрішньоклітинних процесів та значних змін клітинних функцій.

З іншого боку, ліпідний бішар мембран формує у клітині особливу рідинно-кристалічну фазу, яка є структурною основою чи матрицею для білкових, ліпопротеїдних, глікопротеїдних та гліколіпідних компонент мембран. Від фізико-хімічних властивостей ліпідної фази мембран, таких, як в’язкість, поверхневий заряд, полярність, залежить робота мембранних ферментів, каналів та рецепторів.

У ініціюванні процесу деструкції ліпідів за іонізуючих випромінювань важливу роль відіграє активація ПОЛ (див. вище) та фосфоліпазного гідролізу (перш за все активації фосфоліпази А2), що призводить до змін жирнокислотного та фосфоліпідного складу клітинних мембран.

28

Білки. Мембранні білки поділяються на периферійні, які асоціюються із поверхневим ліпідним бішаром, та інтегральні, які перетинають цей бішар. Мембранні білки in vivo на кілька порядків чутливіші до іонізуючого опромінення ніж in vitro. У первинній структурі білків найбільш чутливі амінокислотні залишки, які містять тіолові групи (цистеїн, метіонін), ароматичні ядра (триптофан, тирозин, фенілаланін) та імідазольні групи (гістидин).

Один із шляхів пошкодження мембранних білків внаслідок опромінення - окиснення тіолових груп, яке відбувається:

1) шляхом неферментативної реакції SH-груп із вільними радикалами ліпідів, що призводить до утворення сульфгідрильних радикалів, які взаємодіють із утворенням дисульфідів:

Pr-SH + L· LH + Pr-S·

Pr1-S· + Pr2-S· Pr1-SS- Pr2,

2) внаслідок взаємодії із оксигеном:

Pr-S· + O2 Pr-SO2· похідні сульфонової кислоти

Наслідком цього може бути наступне:

1.Тіолові групи входять до активного центру ферментів, у тому числі іон-транспортуючих, наприклад, Ca2+-АТФази. Інактивація цього ферменту призводить до зростання входу кальцію до клітини та зниження його виходу із клітини, тобто відбувається зростання внутрішньоклітинної концентрації іонів кальцію, що, в кінцевому випадку, викликає пошкодження клітини.

2.Окиснення тіолових груп мембранозв'язаних білків призводить до появи дефектів у ліпідному бішарі плазматичних та мітохондріальних мембран, через які, до клітини надходять іони натрію, а до мітохондрій – іони калію. В результаті зростає осмотичний тиск всередині клітини і мітохондрій та їх набухання. Це призводить до подальшого пошкодження мембран.

Взаємодія мембранних компонент. Біологічні мембрани

відрізняються характерними особливостями. Вони формують бішарові структури малої товщини (6–10 нм), які утворені білковою та ліпідною компонентами з різними властивостями. Цілісна структура мембрани створюється за рахунок гідрофобних та електростатичних взаємодій. Із урахуванням тісного взаємозв’язку між ліпідами та білками в структурі мембран, а також реалізації ними численних

29

функцій, радіаційно-індуковані порушення ліпідів та білків взаємозв'язані та розвиваються скоординовано.

Мембраноструктурні та мембраноасоційовані білки так чи інакше ліпідзалежні. Мембранний бішар володіє відносно малою мікров’язкістю, що дозволяє окремим компонентам проявляти високу рухомість у латеральному напрямку. Водночас, це накладає і певні умови: функціонування білкових ассоціатів значно залежить від щільності упаковки (мікров'язкості) мембран. Тому, радіаційноіндуковані зміни складу та властивостей мембранних ліпідів (ступеню їх насиченості та в'язкості) відображаються і на функції мембранних білків.

Особливо тісно пов'язані із ліпідним мікрооточенням інтегральні білки плазматичної мембрани (системи активного транспорту, каналоутворювачі, рецепторні системи і т.д.). Так, Na,K-АТФаза являє собою білково-ліпідний комплекс, в якому ліпіди приймають участь у реалізації структурних перебудов при гідролізі АТФ та транспорті іонів. Структурно-функціональні порушення цього ферменту за умов іонізуючого опромінення досить детально досліджено в широкому діапазоні доз опромінення.

Радіаційно - індуковані зміни у структурі плазматичної та внутрішньоклітинних мембран обумовлені індукцією дозозалежної кількості первинних та вторинних продуктів опромінення. Серед них, найбільше значення для функцій мембран та подальшої долі клітини відіграють вільнорадикальні реакції ПОЛ, особливо індуковані у фосфоліпідному шарі мембрани. Крім того, важливе значення мають зміни мембранних білків, як за рахунок безпосереднього поглинання енергії радіації, так і опосередкованого, за дії активних сполук кисню чи пероксидів ліпідів.

Зміни клітинних функцій, які обумовлені цими процесами:

1.Поява полярних окислених груп в структурі фосфоліпідного бішару призводить до зростання пасивної проникності мембран (втрата клітинами калію і електролітів-метаболітів та вхід до клітини натрію і кальцію), що призводить до набухання клітин та її органел - порушується хемоосмотична функція.

2.Змінюється рельєф клітинної поверхні (зростає доступність до поверхні плазматичної мембрани), спостерігається процес шеддінга.

3.Результатом попередніх змін - активація хеморецепторної, метаболічної та транспортної функцій, можлива інтенсифікація

електронного транспорту в мітохондріальній та мікросомальній мембранах. Ці ефекти, як правило короткочасні, і при зростанні дози