Fedorchenko_Khromatografichni_metodi_analizu

розміщенням функціональних груп. Селективність адcорбції виявляється тоді,

копи геометричне розміщення центрів адсорбції адсорбенту близьке до геометричного розміщення центрів адсорбції адсорбату.

Рідинну адсорбційну хроматографію використовують також для розділення неорганічних сполук. Наприклад, при пропусканні розчину суміші солей феруму(ІІІ), хрому(ІІІ), алюмінію(ІІІ), цинку(1І), кобальту(І1), ніколу(ІІ)

та мангану(П) крізь хроматографічну колонку катіони металів сорбуються в такій послідовності:

на оксиді алюмінію: Fe3+ ~ Cr5t > Al3+ > Zn2+ > Co2+ – Ni2+ > Мпг+; на силікагелі: Fe3+ > Ai3+ > Cr3+ > Zn2+ > Со2+ – Mn2+ > Ni2+

2.4.2. Особливості рідинної розподільної хроматографії

У рідинній розподільній (рідинно-рідинній, екстракційній) хроматографії розділення речовин відбувається внаслідок різного розподілу їхніх молекул між двома рідкими фазами (розчинниками), одна з яких є нерухомою, а інша – рухомою. Розподіл залежить від відносної розчинності речовин у двох розчинниках. Хроматографічна колонка складається з твердого носія

(адсорбенту), на поверхні якого адсорбована нерухома рідка фаза. Нерухома й рухома рідкі фази практично не повинні розчинятись одна в одній.

Для розділення полярних речовин використовують полярну нерухому фазу, найчастіше воду, а рухомою фазою є менш полярні розчинники. При розділенні неполярних речовин полярність фаз протилежна – використовують неполярну нерухому й полярну рухому фази. У такому разі йдеться про рідинну розподільну хроматографію з "оберненою" фазою.

Рухома фаза (елюент) не повинна змішуватися з нерухомою, щоб не вимивати її з колонки. Якщо рухома фаза частково змішується з нерухомою, то можна попередньо наситити нерухому фазу рухомою, а потім адсорбувати її на носії та вводити в хроматографічну колонку, а для розділення неполярних речовин. Найчастіше використовують такі рухомі фази (розчинники), як формальдегід, вода, метанол, етанол, ацетон, діоксан, метилетилкетон,

етиловий етер, бензол, толуол, циклогексан, тетрахлорид вуглецю тощо.

Метод рідинної розподільної хроматографії застосовують для розділення,

ідентифікації та кількісного визначення багатьох органічних речовин, зокрема суміші вуглеводнів, ароматичних карбонових кислот, стероїдів, гербіцидів,

пестицидів, антибіотиків, барвників, алкалоїдів тощо, а також іонів металів у вигляді їх комплексних сполук з неорганічними й особливо органічними лігандами.

102

2.4.3. Гель-хроматографія

Гель-хроматографія (ексклюзійна, молекулярно-ситова) є різновидом рідинної хроматографії, в якій розділення компонентів суміші ґрунтується на розподілі молекул відповідно до їхніх розмірів між розчинником, який знаходиться в порах сорбенту, і тим самим розчинником, який тече між його гранулами. Отже, на відміну від усіх інших методів хроматографічного аналізу в гель-хроматографії нерухомою і рухомою фазами є одна й та сама речовина – розчинник.

Механізм розділення компонентів суміші. У процесі розділення невеликі за розміром молекули дифундують у сорбент, у порах якого знаходиться рідка нерухома фаза, а великі молекули, розмір яких перевищує діаметр пор (каналів)

сорбенту, не проникають у нього і вимиваються з колонки рухомою фазою.Отже, ефективність розділення речовин залетіть від розміру їх молекул та розміру пор сорбенту.

Носії. Хроматографію, яка ґрунтується на розподілі молекул відповідно до їх розмірів, у літературі називають по-різному: молекулярно-ситовою, якщо для розділення молекул використовують цеоліти, які інакше називають молекулярними ситами; гель-проникною, якщо для розділення застосовують полімерні сорбенти, які набухають в органічних розчинниках (полістирол), або

гель-фільтраційною у випадку використання сорбентів, які набухають у воді

(сефадекс).

Носії, які застосовують у гель-хроматографії, повинні мати строго певний розподіл розміру пор, що дає змогу використати їх для розділення сумішей речовин, молекули яких мають певний розмір. Адсорбційна здатність носія має бути мінімальною. Час утримування речовин повинен визначатися лише так званою інклюзією (проникненням) або ексклюзією (непроникненням) молекул у пори. Характеристикою пористості гелю є ступінь набухання (ємність за розчинником) Sr, тобто кількість розчинника у г, яку поглинув 1 г сухого гелю.

103

У гель-хроматографії як носії використовують: м'які гелі – органічні полімери, такі як целюлоза, полістирол, полідекстран, агароза, поліакриламід,

які сильно набухають і мають високу ємність за розчинником; жорсткі гелі,

такі як силікагель, скло, які мало або зовсім не набухають і мають фіксований розмір пop. Перевагу віддають органічним гелям, на яких сорбція речовин відсутня або незначна, і процес розділення зумовлений практично тільки розмірами пор сорбенту і розмірами молекул сорбатів. Носії на основі силікагелів менш зручні, через те що на розділення речовин впливає також їхня адсорбційна здатність, яку важко передбачити.

Для розділення речовин із водних розчинів зазвичай використовують гідрофільні гелі на основі декстрину – поліатомного спирту, який складається із залишків глюкози. Декстрани, зшиті нитками епіхлоргідрину, підготовлені для хроматографії мають фірмову назву – сефадекси. Розділення з органічних розчинників проводять на гідрофобних полістиролах, що мають різний ступінь зшивання (стирогель, порагель тощо).

Для детектування сполук у гель-хроматографії можна використовувати спектрофотометричний і рефрактометричний детектори. Частіше застосовують рефрактометричний детектор, оскільки він є універсальним і витримує високі температури, необхідні для аналізу високомолекулярних важкорозчинних полімерів.

Використання гель-хроматографії. Передусім гель-хроматографію застосовують для відокремлення дуже великих молекул, розміри яких значно більші за розміри пор сорбенту, від малих молекул (іонів), які вільно проникають у фазу сорбенту. Такий процес відбувається, наприклад, при знесоленні білків та інших природних високомолекулярних сполук або при очищенні гемоглобіну від кухонної солі.

Гель-хроматографія знайшла широке застосування для розділення близьких за розмірами молекул органічних речовин, наприклад, тригліцеридів.

Цей різновид хроматографії використовують також для розділення

104

комплексних сполук металів, зокрема тих, що утворюються в природних водах з органічними лігандами різної молекулярної маси.

Нарешті, гель-хроматографію застосовують для визначення молекулярних мас органічних сполук, полімерів синтетичного і природного походження і комплексів металів з високомолекулярними органічними лігандами.

2.4.4. Афінна хроматографія (за біоспецифічною спорідненістю)

Очищені білки широко використовують у фармацевтиці і дослідницькій діяльності, тому отримання високочистих білкових препаратів є важливою лабораторною задачею. Білок, який цікавить дослідника, знаходиться у клітинах у невеликих кількостях разом з іншими білками, які часто мало відрізняються один від одного за фізико-хімічними властивостями, що робить їх розділення можливим лише при застосуванні низки різнорідних трудомістких операцій (осадження, екстракція, гель-хроматографія).

Білкам притаманна певна активність, наприклад ферментативна,

імунологічна, або вони мають специфічну спорідненість до іншого білка чи небілкової сполуки, з якою вони взаємодіють у ході біохімічної реакції.

Біохімічні реакції специфічні. Ферменти, які прискорюють певну реакцію,

взаємодіють тільки з тими субстратами, які задовольняють їхнім структурним вимогам, тобто ферменти розпізнають лише "свої" субстрати. Так само антитіла розпізнають лише "свої" антигенні детермінанти з дуже високим ступенем вибірковості.

Отже, ферменти, антитіла, цукри – органічні сполуки природного походження – можуть селективно і зворотно взаємодіяти одна з одною за рахунок точної стеричної придатності і паралельно діючих полярних,

неполярних, іонних і водневих взаємодій, тобто ці сполуки розпізнають одна одну у природних рідинах. Цю особливість біохімічних реакцій використовують в афінній хроматографії, яку ще називають хроматографією

105

за біоспецифічною спорідненістю. Один із компонентів біохімічної реакції,

його називають афінним лігандом, прищеплюється до поверхні сорбента.

Афінними лігандами можуть бути різноманітні сполуки: білки (антигени,

інгібітори ферментів, антитіла, білки-репресори), нуклеїнові кислоти,

нуклеотиди, стероїди.

Hocії та способи прищеплення афінного ліганду до них. Hocії мають задовольняти таким вимогам:

нерозчинність;

адсорбційна інертність;

достатня пористість і велика питома поверхня;

механічна стійкість;

хімічна стійкість в умовах, необхідних для сорбції і десорбції;

стійкість до дії ферментів і мікробів.

Як носії використовують целюлозу, декстранові гелі, агарозу,

поліакриламід, скло, силікагель тощо.

Отже, в афінній хроматографії до поверхні носія прищеплюють афінний ліганд, який за рахунок біоспецифічної спорідненості може приєднувати певну органічну сполуку природного походження. Особливості поведінки біополімерів у розчинах зумовлюють специфічні особливості афінної хроматографії та її переваги. Молекули певного білка мають сталу конфігурацію. Вона задана первинною структурою білка, тобто послідовністю амінокислот, поєднаних пептидними зв'язками. Активна конфігурація білкових молекул підтримується великою кількістю слабких (нековалетних)

вандерваальсових і водневих зв'язків, що зумовлює термодинамічну стабільність системи. Біологічно важливі взаємодії виникають на малих відстанях (0,3-0,5 нм). Якщо конфігурація двох молекул така, що їхні поверхні можуть стикатися великою кількістю атомів, то виникає сильна взаємодія.

106

Послідовність розділення в афінній хроматографії включає: пропускання проби крізь колонку, вимивання речовини, яка не взаємодіє із сорбентом,

елюювання досліджуваної сполуки з колонки.

Для оптимальної сорбції нерозчинний носій повинен мати достатньо пористу поверхню, щоб макромолекула мала достатній простір для взаємодії з афінним лігандом. Важливими є також стеричний фактор, концентрація ліганду, іонна сила, рН, швидкість потоку.

Елюювання є особливим етапом в афінній хроматографії, оскільки більшість звичайних розчинників не забезпечує вимивання речовин із колонки.

Органічні розчинники, які спричинюють денатурацію білків, є несумісними з більшістю матеріалів афінної хроматографії на основі ферментів. Процес денатурації часто є незворотним. Тому на етапі елюювання слід застосовувати конкуруючий ліганд або звільняючий реагент, який не викликає денатурацію,

наприклад сечовину за малих концентрацій. Конкурентний ліганд витісняє досліджувану молекулу з комплексу. Білки, які мають біоспецифічну спорідненість до певних сполук, швидко і зворотно змінюють свою просторову конфігурацію у розчині за наявності відносно низьких концентрацій цих сполук навіть у тому випадку, коли їх наявність не змінює рН, іонну силу або температуру розчину. Ця обставина дає змогу елюювати білок зв'язаний з афінним лігандом, уведенням до складу елюенту невеликої кількості вільного ліганду без зміни рН, іонної сили або температури розчину.

Інший спосіб вилучення речовини з колонки – зміна температури або рН розчину.

Для контролю елюювання речовин можна застосовувати радіоактивно мічені зразки. Для цього використовують 14C, 125I. Радіоактивність вимірюють сцинтиляційним лічильником, γ-лічильником. Детектування також можна проводити за світлопоглинанням розчинів в УФ ділянці спектра.

Використання афінної хроматографії. Методом афінної хроматографії можна розділяти широкий спектр біологічних сполук: антитіла, антигени,

107

клітинні органели, кофактори, вітаміни, ферменти, гормони, інгібітори,

пектини, ліпіди, білки, пептиди, амінокислоти, віруси. Крім того, у

фармацевтичній промисловості важливим завданням є розділення і кількісне визначення хіральних сполук. У багатьох випадках терапевтичний ефект забезпечує лише один із набору енантіомерів лікарського засобу. Тому,

важливо їх розділяти й отримувати у чистому вигляді.

Контрольні запитання і задачі

1.В якому агрегатному стані можуть перебувати сорбенти, що використовуються в рідинній колонковій хроматографії?

2.Поясніть принцип приготування нерухомої рідкої фази.

3.Які різновиди хроматографічних методів включає рідинна колонкова хроматографія?

4.Яку перевагу мають мікроколонки, зокрема капілярні, перед макроколонками? У чому полягає суть високоефективної рідинної хроматографії?

5.Як залежить висота, еквівалентна теоретичній тарілці, від швидкості потоку елюенту?

6.Опишіть схему рідинного хроматографа.

7.Які типи детекторів використовують у рідинній колонковій хроматографії та в чому полягає принцип їх дії?

8.Які властивості повинні мати адсорбенти, що застосовуються в рідинній адсорбційній хроматографії? Назвіть найпоширеніші адсорбенти й охарактеризуйте їх.

9.Які властивості повинна мати рухома фаза (розчинник), що використовується в рідинній адсорбційній хроматографії?

10.Що таке елююча здатність рухомої фази (розчинника) і яким параметром вона характеризується?

108

11.У чому відмінність рідинної розподільної (екстракційної) і рідинної адсорбційної хроматографії?

12.У чому полягає суть рідинної розподільної хроматографії з "оберненою"

фазою?

13.Які носії (тверді фази) використовують у рідинній розподільній хроматографії та які мають бути їх властивості?

14.Які органічні сполуки використовують як рідкі нерухомі фази і які властивості вони повинні мати?

15.У чому полягає зміст гель-хроматографії? Які тверді фази застосовують у цьому виді хроматографічного аналізу?

16.У чому полягає суть афінної хроматографії?

17.Які носії використовують в афінній хроматографії? Які вимоги ставляться до них?

18.Назвіть особливості елюювання молекул в афінній хроматографії.

19.Назвіть галузі застосування афінної хроматографії.

2.5.Площинна хроматографія

У 1938 р. радянські вчені, співробітники Українського інституту експериментальної фармації М.А.Ізмайлов і М.С.Шрайбер започаткували метод тонкошарової хроматографії. Значного поширення метод набув завдяки працям німецького професора Е.Шталя. У 1944 р. А.Мартін разом зі співробітниками Р.Консденом і А.Гордоном запропонували розподільний варіант хроматографії на папері.

До площинної (планарної) хроматографії належать такі її різновиди, як

хроматографія на папері й тонкошарова хроматографія. На відміну від рідинної та газової колонкової хроматографії в методах площинної хроматографії розділення речовин відбувається в тонкому шарі сорбенту, який нанесено на скляну або іншу пластинку чи на спеціальний папір для хроматографії, який одночасно є носієм нерухомої рідкої фази. Очевидно, що

109

цими методами можна розділити тільки ті речовини, які розчиняються в рідкій рухомій фазі, й неможливо розділити газові суміші. Тому в тонкошаровій хроматографії використовують тільки основні положення рідинної адсорбційної, розподільної та іонообмінної хроматографії.

У площинній хроматографії рухома рідка фаза пересувається уздовж тонкого шару твердої або рідкої нерухомої фази під дією капілярних сил. Тому її різновиди близькі між собою за технікою виконання аналізу і в них застосовується аналогічна апаратура. Основним недоліком площинної хроматографії порівняно з колонковою є практична неможливість застосування довгих шарів сорбенту – стандартні пластинки для тонкошарової хроматографії мають довжину 20 см, а в хроматографії на папері довжина паперової смуги не перевищує 30-40 см. Це може виявитися недостатнім для повного розділення речовин за малої селективності сорбції.

Однак перевагою площинної хроматографії перед рідинною колонковою

(крім капілярної) є швидше розділення, що зумовлено незначним вільним об'ємом рухомої фази Vо та об'ємом сорбенту Vа.

2.5.1. Техніка проведення аналізу

За технікою виконання аналізу розрізняють такі різновиди площинної хроматографії: одновимірна й двовимірна, висхідна або низхідна, кругова.

Схему розділення двох речовин методом одновимірної висхідної хроматографії наведено на рис. 35. На нижню частину паперової смуги або тонкого шару сорбенту (лінія старту) наносять мікропіпеткою певний об'єм розчину, що аналізується. При цьому бажано отримати на сорбенті пляму якомога меншого діаметра (2-3 мм). Для цього після нанесення кожної невеликої порції досліджуваного розчину треба висушувати пляму, яка утворюється на сорбенті. Досліджуваний розчин наносять на відстані 1 см від кінця смуги (пластинки з сорбентом) і переносять паперову смужку або пластинку в камеру для хроматографування, в якій знаходиться розчинник

110