По группам устойчивости к ржавчинным заболеваниям

Степень поражения, %	Устойчивость, балл	Оценка сортов
0	9	Иммунные
До 10	8	Высокоустойчивые
11-20	7	Устойчивые
21-50	5	Среднеустойчивые
51-75	3	Восприимчивые
Свыше 75	2	Сильновосприимчивые
До 100	1

Форма представления результатов. Результаты должны быть представлены в тетради для лабораторных работ в виде:

1. результата определения комплексного показателя устойчивости восприимчивого сорта (стандарт);

2. результатов определения комплексного показателя устойчивости сортов;

3. результатов оценки устойчивости сортов по универсальной шкале.

4. вывода об устойчивости сортов.

Работа 9. Выявление скрытой вирусной и бактериальной

инфекции в растениях картофеля методом иммуноферментного анализа (ИФА)

(2 часа)

Цель работы – изучить метод выявления скрытой вирусной и бактериальной инфекции в растительном материале.

Задачи:

- изучить метод иммуноферментного анализа (ИФА) и приобрести навыки выявления скрытой вирусной и бактериальной инфекции картофеля;

- оценить чистоту образцов картофеля от вирусной инфекции.

Полученные знания углубляют понимание тем:

- Патологический процесс;

- Оценка устойчивости к болезням и вредителям.

Приобретенные навыки необходимы в практической работе селекционеров и семеноводов для оценки и отбора устойчивых либо очищенных от инфекции растений.

Базовый материал. Студент должен владеть знаниями по темам следующих дисциплин:

- Защита растений – Болезни картофеля;

- Иммунитет растений – Оценка устойчивости к заболеваниям и вредителям»;

- Семеноводство и семеноведение – Семеноводство картофеля.

Студент должен обладать навыками работы с биохимической лабораторной техникой.

Входной контроль. Подготовьтесь к ответу на вопросы:

1. Какие возбудители болезней картофеля способны накапливаться в растениях в скрытой форме?

2. Как проявляются симптомы вирусных заболеваний картофеля в полевых условиях?

3. Как проявляются симптомы бактериальных болезней картофеля?

Теоретические пояснения

Особенностью картофеля как вегетативно-размножаемой культуры является способность накапливать бактериальные и вирусные инфекции, которые проявляются на определенных этапах развития растений (скрытые инфекции). При сильном инфицировании наблюдается выпады растений, а также резкое снижение урожайности и качества продукции.

Для выявления скрытой вирусной и бактериальной применяют высоко чувствительные методы иммунодиагностики. Иммунодиагностические методы основаны на реакциях, происходящих между поверхностно-активными веществами патогенов (антигены) с высоко специфичными защитными белками (антителами), возникающими в организме животных при введении микроорганизмов. Введение в кровь животных антигенов называется иммунизацией.

Иммунодиагностические методы относятся к числу наиболее быстрых и чувствительных методов анализа. Они широко применяются в селекции и промышленном семеноводстве для выявления устойчивых форм и контроля чистоты растений от скрытой инфекции. Для работы с картофелем широко используют метод иммуноферментного анализа (ИФА), который дает возможность не только выявить вирусы и бактерии в тканях растений, но и количественно оценить их накопление в растениях.

ИФА является разновидностью «сэндвич»-метода иммунологической диагностики. Точность метода обусловлена применением очищенной фракции антител, а также использованием цветной ферментативной реакции, что позволяет проводить количественный анализ содержания патогена в соке растений. Схема ИФА-анализа представлена на рисунке 5.

Е Е Ат Ат Ат Ат Ат + Субстрат + + Е Измерение продукта реакции

Рис.5. Схема иммуноферментного анализа ("сандвич-вариант"), Ат - им­мобилизованные антитела; Аg - определяемый антиген; Ат-Е - конъюгат анти­тело-фермент.

Материалы и оборудование

1. Проростки, листья или пробирочные растения разных сортов картофеля.

2. Планшеты для сока растений

3. Положительный контроль (растворы очищенных вирусов и бактерий в глицерине).

4. Отрицательный контроль - сыворотка крови неиммунизированного животного

5. Платы для иммуноферментного анализа

6. Микропипетки на 10 и 100 мкл.

7. Специфические сыворотки (5 видов) к возбудителям вирусных и бактериальных заболеваний картофеля: поливалентная – к вирусам X, S, M, F, моновалентные – к вирусам Y и L, к черной ножке и кольцевой гнили.

8. Набор реактивов для иммуноферментного анализа, включающий растворы антител к вирусам, конъюгаты антител с пероксидазой хрена, ортофенилендиамин, перекись водорода, буферные растворы, детергент.

9. Термостат

10. Микрокалориметр

Порядок выполнения работы

Работа выполняется парами. Каждая пара проводит ИФА к конкретному патогену.

1. Отожмите сок растений в лунки планшета

2. Возьмите платы для ИФА с предварительно нанесенными на них антителами к различным видам вирусов или бактерий. С помощью микропипетки объемом 10 мкл внесите в одну лунку раствор буфера – отрицательный контроль, во вторую лунку – положительный контроль (раствор вируса в глицерине), в остальные лунки – сок анализируемых растений в 2 повторностях. Поставьте платы в термостат с температурой 37^оС на 1 ч.

3. Промойте платы раствором буфера.

4. Внесите в лунки платы по 100 мкл раствора ортофенилендиамина и перекиси водорода. Через 10 мин пронаблюдайте оранжевое окрашивание в лунках с положительным контролем, а также с соком инфицированных растений.

5. Проанализируйте интенсивность цветной реакции с помощью микрокалориметра. Определите интенсивность заражения растений (в процентах от положительного контроля), исходя из того, что интенсивность окрашивания пропорциональна количеству вирусов в образцах.

Рекомендации по выполнению работы

При выполнении работы для точности измерений необходимо использовать для каждого растения и реактива разовые наконечники микропипеток. При внесении сока и реактивов нужно тщательно выдерживать рекомендуемый объем, т.к. передозировка может привести к неспецифическим реакциям и искажению результатов.

Вид отчетности. Результаты необходимо представить в тетради для лабораторных работ в виде:

1) схемы метода;

2) вывода о наличии или отсутствии скрытой вирусной и бактериальной инфекции в образцах;

3) вывода о количестве скрытой инфекции (% от положительного контроля).

СПИСОК Рекомендуемой ЛИТЕРАТУРЫ

Изучение генетических ресурсов зерновых культур по устойчивости к вредным организмам. Методическое пособие / под ред. Е.Е. Радченко. – М.: Россельхозакадемия, 2007. – 430 с.

Плотникова Л.Я. Иммунитет растений на устойчивость к болезням и вредителям: учеб. для вузов / Л.Я. Плотникова. – М.: КолосС, 2007. – 359 с.

Семеноводство зерновых культур в Западной Сибири / под ред. В.П. Шаманина. – Омск: Изд-во ФГОУ ВПО ОмГАУ, 2008. – 302 с.

Библиографический список

Гешеле Э. Э. Основы фитопатологической оценки в селекции растений./ Э. Э. Гешеле. - М.: Колос, 1978.- 206 с.

Доспехов Б.В. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований)./ Б.В. Доспехов – М.: Колос. – 1984. – 416 с.

Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков / Б.В. Анисимов [и др.]. – М.: Картофелевод, 2009. – 272 с.

Изучение генетических ресурсов зерновых культур по устойчивости к вредным организмам. Методическое пособие / под ред Е.Е. Радченко – М.: Россельхозакадемия, 2007. – 430 с.

Инструкция по использованию иммуноферментного диагностического набора для определения вирусов картофеля /РСХА, НПО по картофелеводству. – Коренево, 1993 – 9 с.

Кирай З. Методы фитопатологии / З. Кирай, [и др.]. – М.: Колос, 1974. – 343 с.

Киселев Е.П. Селекция и семеноводство картофеля на Дальнем Востоке. / Е.П. Киселев, А.К. Новоселов - Хабаровск, 2001. – 162 с.

Методика по оценке устойчивости сортов полевых культур к болезням на инфекционных и провокационных фонах / В.А. Захаренко [и др.]. – М.: Россельхозакадемия, 2000. – 88 с.

Методы оценки оздоровленных сортов и меристемных линий в элитном семеноводстве картофеля.- М.: НИИКХ. – 1991. – 39 с.

Методы полевой и лабораторной оценки неспецифическрй устойчивости расте­ний к болезням // Типы устойчивости растений к болезням: Материалы научного семинара. - СПб, 2003. - С. 17-24.

Михайлова Л.А. Лабораторные методы клонирования возбудителя бурой ржавчины пшеницы / Л.А., Михайлова, К.В. Квитко // Микология и фитопатология. – 1970. – Т.4, вып.3. – С.269-273.

Плотникова Л.Я. Иммунитет растений на устойчивость к болезням и вредителям: учеб. для вузов / Л.Я. Плотникова. – М.: КолосС, 2007. – 359 с.

Семеноводство зерновых культур в Западной Сибири / под ред. В.П. Шаманина. – Омск: Изд-во ФГОУ ВПО ОМГАУ, 2008. – 302 с.

Создание сортов зерновых культур, устойчивых к головневым заболеваниям в Западной Сибири. Метод. рекомендации / РАСХН. Сиб. отд-ние. СибНИИРС, сост. Ж.А. Бахарева, Ю.А.Христов. – Новосибирск, 2003. – 49 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение	3
Тема 1. Изменчивость патогенов. Определение физиологических рас и генетической структуры популяции возбудителя бурой ржавчины	5
Работа 1. Освоение метода отсеченных листьев (2 часа)	9
Работа 2. Определение физиологических рас и расового состава популяции возбудителя бурой ржавчины (1 час)	10
Тема 2. Оценка неспецифической устойчивости злаков к листовым болезням	11
Работа 3. Заражение сортов овса инокулюмом популяции корончатой ржавчины (1 час) Работа 4. Определение неспецифической устойчивости образцов (2 часа)	12 14
Тема 3. Создание инфекционных фонов.	17
Работа 5. Определение инфекционной нагрузки (1 час)	18
Работа 6. Заражение пшеницы пыльной головней с помощью шприц-метода для создания инфекционного фона (1 час)	20
Тема 4. Методы учета устойчивости растений	22
Работа 7. Методы учета по распространению болезни 7.1. Оценка пораженности пшеницы головневыми заболеваниями по апробационному снопу (1 час) 7.2. Метод ускоренной лабораторной оценки устойчивости злаков к пыльной головне (1 час)	23 24
Работа 8. Определение устойчивости пшеницы к ржавчине по типу реакции и степени поражения (2 часа)	28
Работа 9. Выявление скрытой вирусной и бактериальной инфекции в растениях картофеля методом иммуноферментного анализа (ИФА) (2 часа)	31
Список рекомендуемой литературы	35
Библиографический список	36

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ бюджетное ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОфессионального образования

«омский государственный аграрный уНИВЕРСИТЕТ

имени П.А. Столыпина»

(ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина)

Кафедра селекции, генетики и физиологии растений

Л.Я. Плотникова, Н.В. Дергачева

УМКД

ИММУНИТЕТ РАСТЕНИЙ

И СЕЛЕКЦИЯ НА УСТОЙЧИВОСТЬ

К БОЛЕЗНЯМ И ВРЕДИТЕЛЯМ

Методические указания

к лабораторным занятиям

по дисциплине «Иммунитет растений и селекция на устойчивость

к болезням и вредителям»

в составе ООП ВПО 110204.65 – Селекция

и генетика сельскохозяйственных культур

2-е издание, переработанное

Омск

Издательство ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А.Столыпина

2011

41