48.Применение генетических методов в диагностике инфекционных заболеваний. Пцр, днк и рнк зондирование.

Для диагностики инфекционных заболеваний генетическими методами маркером возбудителя является его геном. Методы индикации нуклеиновых кислот применяют для диагностики вирусных инфекций, для идентификации бактерий (особенно таких, которые трудно выделить) и для определения точного таксономического положения микроорганизмов. Методы позволяют обнаружить микроорганизм в исследуемом материале (воде, продуктах, материале от больного) по наличию ДНК без его выделения в чистую культуру.

Метод молекулярной гибридизации основан на способности ДНК и РНК специфически соединяться ( гибридизироваться ) с комплементарными олигонуклеотидными фрагментами, искусственно синтезированными и меченными ферментом, флюорохромом или изотопом. Эти фрагменты называются зондами .

Для проведения молекулярной гибридизации молекулу исследуемой ДНК расплетают, одну нить закрепляют на специальном фильтре, который помещают в раствор, содержащий меченый зонд (рис. 4). Создаются условия, благоприятные образованию двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль. После окончания гибридизации и отмывания несвязавшихся продуктов проводится детекция образовавшегося комплекса при помощи соответствующей метки.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на многократном увеличении числа копий ( амплификации ) определенного участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой (рис. 5). ПЦР - это очень чувствительный метод, теоретически для получения результата достаточно наличие в материале одной молекулы ДНК.

ПЦР состоит из трех основных этапов: подготовки исследуемой пробы (изоляция ДНК или РНК), собственно ПЦР и детекции продукта ПЦР (амплифицированной ДНК). При использовании РНК в качестве матриц для ПЦР предварительно на этой РНК-матрице посредством фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) синтезируют комплементарную ДНК, которая затем используется в качестве матрицы в ПЦР. После того, как из бактерий Thermous thermophilis удалось получить ДНК-полимеразу, которая наряду с полимеразной обладает еще и обратно-транскриптазной активностью, удалось совместить эти две реакции. Этот вариант ПЦР широко применяется для детекции РНК-содержащих вирусов, определения экспрессии вирусных, бактериальных и клеточных генов по их РНК.

Для проведения ПЦР необходимы пять основных компонентов:

*фермент ДНК-полимераза;

*пара олигонуклеотидных праймеров;

*набор нуклеотидов;

*копируемая ДНК;

*ионы Mg +2 , необходимые для функционирования ДНК-полимеразы.