1.6. Микроскопия в тёмном поле

В основе метода лежит явление Тиндаля — освеще­ние объекта косыми лучами света. Эти лучи, не попадая в объектив, остаются невидимыми для глаза, поэтому поле зрения выглядит темным. В то же время оптиче­ски неоднородные клетки, находящиеся в поле зрения и попадающие в сферу прохождения лучей, отклоняют их в такой степени, что лучи попадают в объектив. По­скольку лучи света идут именно от объектов, наблюда­тель видит их в темном поле интенсивно светящимися.

Темное поле зрения можно создать в светооптическом микроскопе, заменив обычный конденсор темнопольным и применив источник сильного света. Однако, эффект тёмного поля может быть достигнут только в том случае, если апертура конденсора превышает на 0,2—0,4 единицы апертуру объектива. Для исследова­ния в темном поле рекомендуют конденсор с апертурой около 1,2 и объективы с апертурой 0,65—0,85. Важно обращать внимание на толщину предметных (0,8— 1,2 мм) и покровных (0,17 мм) стекол, толщину пре­парата (в воде) и чистоту используемых стекол. Чем толще препарат и чем больше в нем посторонних ча­стиц, преломляющих световые лучи, тем менее контраст­но получаемое изображение, так как каждая частица, отражая лучи, освещает поле зрения.

Метод используется при исследовании живых кле­ток микроорганизмов. Особенно он ценен для функцио­нально-морфологического изучения крупных объектов типа дрожжей. Цитоплазма дрожжевых организмов (при условии яркого источника света и хорошего апо-хроматического иммерсионного объектива) слабо и рав­номерно опалесцирует. На ее фоне четко различаются черные, оптически пустые вакуоли. Капли жира выде­ляются как сильно блестящие гранулы. Протопласт погибающих клеток опалесцирует молочно-белым цве­том.

Контрольные вопросы:

1. В каких случаях применяется микроскопия в тёмном поле?

2. Чем отличается конструкция тёмнопольного микроскопа от обычного светового?

3. Какой конденсор и какие объективы применяют в тёмном поле?

1.7. Фазово-контрастная микроскопия

Человеческий глаз различает только длину (цвет) и амплитуду (интенсивность, контрастность) световой вол­ны, но не улавливает различий в фазе. Почти все живые клетки прозрачны, так как свето­вые лучи, проходя через них, не меняют своей ампли­туды, хотя и изменяются по фазе. Превратить «фазо­вый» (неконтрастный) препарат в «амплитудный» (конт­растный) можно, либо окрашивая объект (для живых клеток этот прием малопригоден), либо снижая апер­туру конденсора путем прикрывания диафрагмы (при­ем также нежелателен, так как снижает разрешающую способность микроскопа).

Метод фазово-контрастной микроскопии разработан для наблюдения за прозрачными объектами, он осно­ван на преобразовании фазовых изменений, претерпе­ваемых световой волной при прохождении через объ­ект, в видимые аплитудные с помощью определенного оптического устройства. Если в объектив обычного микроскопа вмонтировать специальный диск - фазовую пла­стинку с кольцом (получается путем напыления диска солями редких металлов толщиной в несколько десятых микрометра), а в конденсор - кольцевую диафрагму (непроницаемую для лучей света пластинку с прозрач­ной щелью в виде кольца), так чтобы через конденсор и объектив проходило лишь кольцо света, которое за­тем совмещается с кольцом фазовой пластинки объек­тива, то фазы проходящего светового луча сдвигаются (обычно на 1/4 длины волны), фазовые изменения пере­ходят в амплитудные, и препарат становится контраст­ным.

Для проведения исследований необходимо в допол­нение к световому микроскопу иметь фазовоконтрастное устройство (наиболее широко распространена мо­дель КФ-4), которое состоит из фазовых объективов (на оправе имеется буква «Ф»), конденсоров с набором кольцевых диафрагм и вспомогательного микроскопа (оптического устройства, помещаемого в тубус вместо окуляра при установке фазового контраста).

Метод применяют для исследования живых клеток микроорганизмов, контрастность которых достигается оптическим путем без вмешательства в физиологиче­ские процессы изучаемых объектов.

Контрольные вопросы:

1. В каких случаях применяется фазово-контрастная микроскопия?

2. На чём основан метод фазово-контрастной микроскопии?

3. Чем отличается конструкция фазово-контрастного микроскопа от обычного светового?

4. Как устроена фазово-контрастная модель КФ-4?