6.2 Использование мутагенов для целей клеточной селекции

Использование мутагенов позволяет существенно расширить спектр сомаклональной изменчивости и благодаря этому повысить эффективность клеточной селекции. В качестве исходного материала для экспериментального мутагенеза используют каллюсные и суспензионные культуры и культуры протопластов. Также нашли применение обработки мутагенами семян с последующим получением из зародышей или проростков культуры клеток in vitro, в которой, собственно, проводят клеточную селекцию. Для этих же целей проводят обработку мутагенами пробирочных растений или эксплантатов, которые дают морфогенный каллюс, или культуры, способные к эмбриогенезу.

Каллюсные культуры – наиболее доступный материал для мутагенеза. Применяют, как правило, каллюс, который еще не пассировали или культуру после нескольких пассажей, которая не утратила способность к регенерации растений. Для каллюсной культуры как объекта мутагенеза характерен ряд недостатков: относительно медленный рост, неравноценный для разных слоев клеток эффект мутагенов или селективных агентов. Наряду с устойчивыми к селективному агенту клетками возможно выживание чувствительных клеток, находящихся в непосредственном контакте с мутантными, в связи с чем не исключено выделение химерных клеточных линий и растений-регенерантов. Рост отдельных устойчивых клеток может подавляться мертвыми клетками. Из-за полиплоидизации культур сложно индуцировать рецессивные мутации.

Некоторых из этих недостатков лишены суспензионные культуры. Однако следует иметь в виду, что в суспензиях во многих случаях преобладают не единичные клетки, а клеточные агрегаты, для которых характерны те же недостатки, что и для каллюсных культур. В мутационной клеточной селекции наибольшее распространение получил метод высева суспензий в агаризованные селективные среды.

Во многих случаях оптимальным объектом для клеточной селекции является культура протопластов. Использование больших однородных популяций активно делящихся гаплоидных или диплоидных мезофильных протопластов позволяет не только получать и эффективно отбирать интересующие исследователя мутанты, но и проводить количественные исследования мутагенеза, анализировать степень экспрессии индуцируемых фенотипических изменений на клеточном и организменном уровне. Однако для многих важных сельскохозяйственных, древесных и декоративных растений методы культуры протопластов практически не применимы (например, для большинства злаковых культур) или являются недостаточно отработанными.

Методы экспериментального мутагенеза растений начали применять задолго до того, когда появилась возможность использования мутагенов для целей клеточной селекции. В настоящее время накоплен обширный объем знаний об активности и особенностях использования различных химических веществ и физических факторов для индукции хозяйственно-ценных мутаций растений. В результате в распоряжении исследователей имеется широкий арсенал высоко активных химических мутагенов. Для целей клеточной селекции широкое распространение получили такие мутагены, как этил-метансульфонат (ЭМС), N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин (НГ), N-этил-N-нитрозомочевина (НЭМ), N-нитрозометилмочевина (НММ) и другие. С их помощью получен ряд мутантов, представляющих научный и практический интерес: с различными типами хлорофилл-дефектности, устойчивые к аналогам аминокислот и основаниям нуклеиновых кислот, антибиотикам, токсинам, различные ауксотрофы.

Из названных мутагенов выделяется НЭМ. Из-за химической нестабильности это вещество быстро разлагается в питательной среде, благодаря чему оно может применяться для мутагенной обработки клеточных культур без последующего отмывания их от мутагена. Помимо удобства в использовании для НЭМ характерна высокая мутагенная активность. Так, в исследованиях Marton et al. (1982) применение НЭМ позволило в 20 раз увеличить частоту устойчивых к хлорату клонов в культуре гаплоидных протопластов табака N. plumbaginifolia, а при мутагенезе диплоидных протопластов этого же вида появление клонов, устойчивых к стрептомицину, возросло в 30 раз (Maliga et al. 1982).

Наряду с химическими мутагенами для целей клеточной селекции широко применяют физические мутагенные факторы – ионизирующее (рентгеновские и гамма-лучи) и ультрафиолетовое облучение.

Следует, однако, признать, что для клеточной селекции сельскохозяйственных растений предпочтительным считается использование спонтанной сомаклональной изменчивости. В этом случае частота появления мутантов с нежелательными отклонениями развития не так высока, как при использовании мутагенов. Ауксотрофные и другие редкие мутанты удалось выделить только благодаря использованию эффективных мутагенов.