3.4. Ферменты, действующие на пептидные связи.

Классификация (с подразделением на 11 подклассов) учитывает различия между пептидазами и протеазами, выделяет ферменты, гидролизующие дипептиды или более крупные пептиды, отщепляющие одну или большее число аминокислот, атакующие связь на С-или N-конце. Протеиназы в соответствии с механиз­мом катализа подразделяются на сериновые, тиоловые и металлозависимые. Например:

3.4.21. Сериновые протеиназы. Например: химо-трипсин, трипсин, плазмин, факторы свертывания крови IХа и ХIа.

3.4.23. Карбоксильные (кислые) протеиназы. На­пример: пепсины А, В и С.

4. Лиазы. Ферменты, отщепляющие группы от субстратов по негидролитическому механизму, с образованием двойных связей.

С(X)— С(Y) = X— Y + С = С

Ферменты, действующие на связи С — С, С — О, С— N, С — S и С — галоид. Некоторые подгруппы:

4.1.2. Альдегид- лиазы. Например:

4.1.2.7. Кетозо-1-фосфат-альдолаза [альдолаза]

Кетозо-1 -фосфат = Дигидроксиацетонфосфат + Альдегид.

4.2. Углерод — кислород лиазы. Например: 4.2.1.2. L-малат — гидро-лиаза [фумараза]

L-малат = Фумарат + Н₂О.

5. Изомеразы. В этот класс включены все фер­менты, катализирующие взаимопревращения опти­ческих, геометрических и позиционных изомеров. Некоторые подклассы;

5.2. Цис-транс-изомеразы.

5.3. Ферменты, катализирующие взаимопревраще­ние альдоз и кетоз. Например:

5.3.1.1. D-Глицеральдегид-З-фосфаткетолизомераза [триозофосфатизомераза]

D-Глицеральдегид-З-фосфат = Дигидроксиацетонфосфат.

6. Лигазы. (от лат. лигаре — связывать). Фермен­ты, катализирующие соединение двух молекул, сопряженное с разрывом пирофосфатной связи АТР или подобного соединения. В этот класс включены ферменты, катализирующие реакции, в ходе кото­рых образуются связи С—О, С—S, С—N и С—С. Некоторые подклассы:

6.3. Ферменты, катализирующие образование связей С—N. Например:

6.3.1.2. L-Глутамат:аммиак лигаза (ADP) [глутаминсинтетаза]

АТР + L-Глутамат + NH₄+ = ADP + Ортофосфат + L-Глутамин.

6.4. Ферменты, катализирующие образование связей С—С. Например:

6.4.1.2. Ацетил-СоА:СО₂ лигаза (ADP) [ацетил-СоА — карбоксилаза]

АТР + Ацетил-СоА + СО₂ = ADP + Р_i + Малонил-СоА.

Факторы, влияющие на активность ферментов:

Активность фермента зависит от:

• Кислотности среды;

• Температуры;

• Концентрации фермента;

• Концентрации субстрата;

• Концентрации кофакторов (ионов металлов, неорганических и органических молекул);

• Наличия ингибиторов;

• Присутствия детергентов

Применение ферментных препаратов

Применение ферментных препаратов в позволяет добиться высокой эффективности и обеспечивает высокую специфичность, в том числе и стереоспецифичность проводимых реакций. Ферменты позволяют проводить реакции при умеренных температурах и нормальном давлении.

Обеспечение оптимальной активности фермента при технологическом процессе:

Для каждого фермента имеется определенное оптимальное значение pH и температуры. Нередко для промышленных процессов используются термофильные ферменты, что ускоряет процесс, и обеспечивает дополнительные преимущества. Концентрация фермента также должна быть оптимальной. Оптимальной должна быть и концентрация субстрата. Кроме того, если наблюдается ингибирование продуктом, нужно позаботиться о выведении продукта из зоны реакции.

В реакционной смеси должны находиться необходимые кофакторы.

Необходимо позаботиться о том, чтобы в реакционной смеси не было примесей, способных ингибировать используемый фермент.

Пример: при производстве фруктозного сиропа из крахмала используются последовательно ферменты альфа-амилаза и глюкозоизомераза. Для стабилизации альфа-амилазы при проведении процесса при температуре около 100^оС добавляют ионы кальция, однако ионы кальция подавляют активность глюкозаизомеразы, поэтому после ожижения и осахаривания крахмала ионы кальция удаляют ионообменной хроматографией. Кроме того, активность глюкозоизомеразы подавляется олигосахаридами, поэтому при получении глюкозного сиропа добиваются максимально полного гидролиза.

Стабилизация фермента:

Стабилизация – предотвращение денатурации фермента. Денатурация – нарушение вторичной и третичной структуры белка-фермента под действием различных факторов среды: температура, кислотность, денатурирующие агенты, взаимодействие с поверхностями, вспенивание.

Замечание. При проведении реакции ферментом в растворе необходимо избегать вспенивания реакционной смеси.

Методы стабилизации:

А. Добавление стабилизирующих веществ.

К общим методам повышения устойчивости ферментов в реакционной смеси относятся добавление веществ, повышающих вязкость (глицерин, сахароза и т.п.), добавление стабилизирующих полимеров (полиэтиленгликоль) добавление дополнительного белка (например, бычьего сывороточного альбумина). Однако эти методы довольно дороги и их не всегда удается применять в технологическом процессе.

Кроме того, многоатомные спирты могут повышать устойчивость водородных связей в белке.

На некоторые ферменты оказывает стабилизирующее воздействие добавление определенных ионов металлов. В частности альфа-амилаза из Bacillus caldolytics стабилизируется ионами кальция (значительно повышается термостабильность).

Некоторые ферменты стабилизируются добавлением небольших количеств органических растворителей (этанол, изопропанол).

Б. Химическая модификация белка.

В частности для трипсина – конденсация поли-аланина (около 10 остатков АК) с аминогруппами белка повышает его устойчивость к протеолизу и тепловой инактивации.

Для папаина – образование поперечных связей с помощью глутарового альдегида повышает термостабильность белка.

В. Иммобилизация белка.