4.5. Жидкостная хроматография.

Жидкостная хроматография (ЖХ) - метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой является жидкость. Подвижная фаза в жидкостной хроматографии выполняет двоякую функцию: 1) обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке

(подобно подвижной фазе в газовой хроматографии); 2) регулирует константы равновесия, а, следовательно, и удерживание в результате взаимодействия с неподвижной фазой (сорбируясь на поверхности) и с молекулами разделяемых веществ.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Это один из эффективных методов анализа и разделения сложных смесей. Широкое применение этого метода связано с большим диапазоном молекулярных масс веществ, с которыми можно работать: от нескольких единиц до десятков миллионов. По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делится на адсорбционную, распределительную, ионообменную и эксклюзионную.

Одним из вариантов жидкостной хроматографии является жидкостно-адсорбционная хроматография – это метод, в котором неподвижной фазой является твердый адсорбент. В адсорбционной хроматографии разделение осуществляется за счет разницы в адсорбируемости молекул, проходящих через слой частиц сорбента, покрытых неподвижной фазой в виде тонкого слоя или поверхностно привитых радикальных групп.

В зависимости от природы подвижной (ПФ) и неподвижной (НФ) фазы различают нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографию. В нормально-фазовой ВЭЖХ НФ – полярная (чаще всего силикагель), а ПФ – неполярная (гексан, либо смеси гексана). Удерживание веществ растет с увеличением их полярности. В обращенно-фазовой хроматографии неподвижная фаза – неполярная (гидрофобные силикагели с привитыми группами С8, С18); ПФ – полярная (смеси воды и полярных растворителей: ацетонитрила,

метанола, тетрагидрофурана и др.). Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Подвижная фаза, прежде всего, должна растворять разделяемые компоненты. Основными характеристиками подвижных фаз являются ее

элюирующая способность и селективность. Элюирующая способность подвижной фазы – это ее способность вступать в межмолекулярные взаимодействия с разделяемыми соединениями и группами на поверхности сорбента. Селективность подвижных фаз связана с их способностью к специфическим взаимодействиям с сорбатами, определяемыми их структурными признаками. Селективность, как и элюирующая способность, определяется в первую очередь природой

более сильного компонента смеси.

Система для проведения разделения методом ВЭЖХ.

Состоит из нескольких блоков: насоса, дозатора, колонки, детектора и регистрирующего устройства.

2 – насос предназначен для создания постоянного потока растворителя, 3 - инжектор обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку, 4 - колонки для ВЭЖХ, 5 – термостат обеспечивает постоянноство температуры, 6 – детектор, 7 - регистрирующая система

Единого универсального детектора для жидкостной хроматографии не существует. Поэтому в каждом конкретном случае следует подбирать наиболее подходящий детектор. Наиболее распространенным детектором в адсорбционной ВЭЖХ является спектрофотометрический. В процессе элюирования веществ в специально сконструированной микрокювете измеряется оптическая плотность элюата при заранее выбранной длине волны, соответствующей

максимуму поглощения определяемых веществ. Такие детекторы измеряют поглощение света в ультрафиолетовой или видимой области спектра. Детекторы этого типа являются высокочувствительными селективными приборами, позволяющими определять в потоке жидкой фазы весьма малые концентрации веществ. Их показания мало зависят от колебаний температуры и других случайных изменений среды. Одна из важных особенностей спектрометрических детекторов заключается в прозрачности большинства применяющихся в жидкостно-адсорбционной хроматографии растворителей в рабочей области длин волн.

Кондуктометрический детектор используют для определения неорганических анионов и катионов в ионной хроматографии. Принцип его работы основан на измерении электропроводности подвижной фазы в процессе элюирования вещества.

Ионообменная хроматография. В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство с фиксированным зарядом, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами.. Механизм ионного обмена можно представить в виде следующих уравнений:

для анионного обмена

X- + R+Y- ↔ Y- + R+X-

для катионного обмена

X+ + R-Y+ ↔ Y+ + R-X+

В первом случае ион образца X- конкурирует с ионом подвижной фазы Y- за ионные центры R+ ионообменника, а во втором в конкуренцию с ионами подвижной фазы Y+ за ионные центры R- вступают катионы образца Х+.

В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы и силикагели с привитыми ионогенными группами.. Применяемые в ВЭЖХ ионообменные смолы представляют собой в основном сополимеры стирола и дивинилбензола.

В качестве подвижной фазы используют водные растворы солей кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиака. Ионообменное разделение обычно выполняют при применении водных растворов солей, которым придаются буферные свойства, хроматографии применяют следующие буферные растворы: ацетатный, фосфатный, цитратный.

Ионная хроматография – это высокоэффективная жидкостная хроматография для разделения катионов и анионов на ионообменниках низкой емкости. Метод основан на эквивалентном обмене ионов раствора на ионы неподвижной твердой фазы. В этом методе ионообменное разделение ионов сочетают с кондуктометрическим определением их.

Существуют два метода ионной хроматографии:

1) Двухколоночная ионная хроматография, основанная на компенсации (подавлении) электролита, содержащегося в элюенте для разделения смеси ионов на колонке с помощью второй ионообменной колонки, расположенной между детектором и разделительной колонкой.

2) одноколоночная ионная хроматография, основанная на использовании электролита с невысокой электропроводностью. В этом случае компенсационная колонка отсутствует.

Гель-хроматография

Гель-хроматография – метод разделения смесей веществ с различными молекулярными массами путем фильтрации анализируемого раствора через гели.

Разделение смеси веществ происходит в том случае, если размеры молекул этих веществ различны, а диаметр пор зерен геля постоянен и может пропускать лишь те молекулы, размеры которых меньше диаметра отверстий пор геля. При фильтровании раствора анализируемой смеси более мелкие молекулы, проникая в поры геля, задерживаются в растворителе, содержащимся в этих порах, и движутся вдоль слоя геля медленнее, чем крупные молекулы, не способные проникнуть в поры. Таким образом, гель-хроматография позволяет разделять смесь веществ в зависимости от размеров и молекулярной массы частиц этих веществ. Этот метод разделения достаточно прост, быстр и, что самое главное, он позволяет разделять смеси веществ в более мягких условиях, чем другие хроматографические методы.

Основное назначение гель-хроматографии – разделение смесей высокомолекулярных соединений и определение молекулярно-массового распределения полимеров. Примером может служить применение гель-хроматографии для диагностики заболеваний щитовидной железы. Диагноз устанавливают по количеству иода, определенному в ходе анализа.

[17], [18].

Выполнила Лаптева А.