2.4 Ферментативні методи аналізу
Засновані дані методи на використанні хімічних реакцій за участю ферментів. Про вміст досліджуваного компоненту судять або за кількістю кінцевого продукту ферментативної реакції, або, частіше, за початковою швидкістю процесу, покладеного в основу методики визначення. Для спостереження за швидкістю ферментативної реакції застосовують зазвичай інструментальні методи, частіше, люмінесцентні, спектрофотометричні, електрохімічні. Перевагами ферментативних методів аналізу є: висока чутливість, обумовлена активністю ферментів, природою індикаторних реакцій (за допомогою яких визначають речовину) і способами детекції аналітичного сигналу; висока селективність і м'які умови проведення аналізу.
Елементом, що досліджується за допомогою ферментативних методів, можуть бути субстрати (речовини, перетворення яких каталізує фермент), самі ферменти, коферменти (речовини, необхідні для здійснення каталітічної дії ферменту) і ефектори (сполуки, які змінюють каталітичну активність ферменту – активатори, інгібітори). Серед коферментів – НАД і НАДН (відповідає никотінамідаденіндінуклеотід і його відновлена форма), НАДФ і НАДФН (відповідає никотінамідаденінді-нуклеотідфосфат і його відновлена форма), АТФ (аденозінтріфосфат) і ін.
Межа виявлення, нижня і верхня межі визначуваного вмісту компонентів залежать від кінетичних характеристик використовуваної індикаторної ферментативної реакції і, перш за все, каталітичної активності ферменту (рис. 2.6).
Рисунок 2.6 – Електронно-обчислювальний комплекс «АСИС»
Фермент каталізує реакції, в яких беруть участь, як правило, один або два субстрати. У односубстратній реакції концентрація субстрату [S]0 пропорційна швидкості процесу v0 тільки за умови [S]0Км, де Км – константа Міхаеліса. Отже, верхня межа визначуваного вмісту лімітується, як правило, величиною Км. Межа виявлення і нижня межа аналізованого вмісту субстрату визначаються зазвичай тією величиною v0, яка може бути зафіксована вибраним інструментальним методом. Чим менше величина v0 і чим вища каталітична константа швидкості kкат і концентрація [E]0 ферменту, тим нижче межа виявлення і нижня межа визначуваного змісту субстрату. Для двосубстратних реакцій при визначенні субстрату S1 субстрат S2 береться в насичених концентраціях і двосубстратна реакція зводиться до односубстратної. У разі оборотного неконкурентного інгібування ферменту інгібітори I, взаємодіючи з ферментом, утворюють каталітично неактивні комплекси EI. Для інгібіторів цього типу верхня межа визначуваного вмісту лімітується величиною KI =[EI]; межа [E][I] виявлення і нижня межа визначуваного вмісту залежать також і від концентрації ферменту. Такі ж залежності зберігаються і при визначенні оборотних активаторів ферментів. У разі необоротного інгібування ферментативних реакцій нижня межа визначуваного вмісту інгібітору залежить від часу інгібування. Якщо значення константи швидкості цього процесу невелике, відносне зменшення активності ферменту залежить від тривалості процесу інгібування. При чималих кінетичних швидкостях тимчасовою залежністю можна нехтувати, тоді відносне зменшення активності ферменту пропорційне концентрації інгібітору: К= n[I], де n – число молекул інгібітору, що взаємодіє з однією молекулою ферменту. У ферментаційних методах аналізу часто використовують системи, що складаються з декількох зв'язаних реакцій, що каталізуються ферментами. Так, наприклад, у разі системи з двох реакцій продукти першої ферментативної реакції є субстратами для другої ферментативної реакції (індикаторною), що дозволяє підвищити чутливість визначення тієї або іншої сполуки і при необхідності змінити спосіб детекції.
Недоліки ферментативних методів аналізу обумовлені рядом особливостей ферментів: втратою функціональної активності і стабільності ферментів під впливом різних чинників; високою вартістю через неможливості багатократного використання розчинних ферментів і труднощі їх виділення і очищення. Застосування іммобілізованих ферментів розширило можливості ферментативних методів аналізу. Вища стабільність і можливість багатократного використання іммобілізованих ферментів дозволили понизити вартість аналізів, підвищити експресність, проводити хімічний аналіз в потоці і автоматизувати ферментативні методи.
ВИСНОВКИ
Таким чином, в результаті написання курсової роботи було сформовано поняття про основні методики та прилади визначення вмісту важких металів в ґрунтах та продукції рослинництва. Хімічні інгредієнти, що накопичуються в повітрі, воді і ґрунтах, і є техногенними домішками оточуючого людину середовища, надзвичайно небезпечні для живих організмів, тому вивчення результатів антропогенного забруднення навколишнього середовища в наш час набуло виключно важливого значення. Найбільшої уваги заслуговує техногенне накопичення важких металів, особливо в ґрунтах – початковій ланці ланцюга живлення. Настільки ж актуальним є вивчення забрудненості сільськогосподарських культур, оскільки до 70-80% від загальної кількості важких металів, що надходять в організм людини, припадає на рослинну продукцію.
Важкі метали відносяться до токсичних елементів, тому їх визначення є обов'язковим при проведенні екологічних і санітарно-гігієнічних оцінок рівня забруднення ґрунтів.
В роботі ми розглянули чотири основні методи визначення важких металів в ґрунтах та рослинній продукції: атомно-адсорбційний метод спектрального аналізу, метод інверсійної вольтамперометрії і полярографії, спектрофотометричне детектування, ферментативні методи аналізу.
Кожний з методів має відповідне лабораторне обладнання, свої переваги та окремі недоліки.
СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ
Антонович Дж., Брадшов А. Д. Тяжелые металлы, содержащиеся в растениях. – Л.; Нью-Йорк: Академическая пресса, 1971. – С. 2 – 86.
Виноградов А. П. Основные закономерности в распределении микроэлементов между растениями и средой. – М.: Изд-во АН СССР, 1972. – С.7 – 20.
Вуд Дж. Биологические циклы токсических элементов в окружающей среде. – Л.: Наука, 1974. – С. 124 – 131.
Ермаченко Л. А. Атомно-абсорбционный анализ в санитарно-гигиенических исследованиях. Методическое пособие. – М.: Наука и техника, 1997. – 207 с.
Ермаченко Л. А., Ермаченко В. М. Атомно-абсорбционный анализ с графитовой печью. Методическое пособие. – М.: Наука и техника, 1999. – 219 с.
Зырин Н. Г., Каплунова Е. В., Сердюкова А. В. Нормирование содержания тяжелых металлов в системе почва-растение // Химия в сел. хоз-ве. 1985. – № 6. – С. 45 – 48.
Ильин В. Б. Тяжелые металлы в системе почва-растение. – Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1991. – 151 с.
Кирко Е. В., Сорокина Н. М., Галдина Н. Н., Цизин Г. И., Золотов Ю. А. Автоматизированный комплекс оборудования для экспрессного проточного сорбционно-абсорбционного определения тяжелых металлов в растворах. // Заводская лаборатория, 1996. – Т. 62. – №12. – С. 26 – 28.
Методика выполнения измерений массовой концентрации двухвалентных ионов меди, свинца, кадмия и цинка в пищевых продуктах и сырье методом инверсионной вольтамперометрии на вольтамперометрическом анализаторе "Экотест-ВА", МВИ №001-91-99, 1999. – 160 с.
Методические указания по определению кадмия, свинца, меди и цинка в сельскохозяйственной и пищевой продукции методом инверсионной вольтамперометрии после автоклавной минерализации. – М.: Минсельхозпрод России, 1998. – 198 с.
Методические указания по определению марганца и железа в сельскохозяйственной продукции спектрофотометрическим методом после автоклавной минерализации. – М.: Минсельхозпрод России, 1998. – 179 с.
Орлова В. А., Игнатьев Ю. А., Нестерович И. А. // Агрохимический вестник. Химия в сельском хозяйстве. 1997. – №5. – С. 24.
Орлова В. А., Орлова А. Н. Метрологическая аттестация автоклавных модулей МКП-04 и МКП-05 для ускоренной минерализации сельскохозяйственных объектов. Стандартизованная методика автоклавной минерализации аналитических проб при сертификационных испытаниях // Сборник докладов VI научно-практической конференции. – М.,1999. – С. 15.
ОСТ 10-221-98 Почвы, ґрунты, удобрения, сельскохозяйственная и пищевая продукция. Минерализация проб в аналитическом автоклаве НПВФ "Анкон-АТ-2" для определения ртути, свинца, кадмия, мышьяка, меди, цинка, железа, олова, марганца, хрома, никеля, селена, теллура, таллия и бериллия. – М.: Минсельхозпрод России, 1998. – 219 с.
Томпсон М., Уолш Д. Н. Руководство по спектрометрическому анализу с индуктивно связанной плазмой. – М.: Недра, 1988. – 287 с.
Чудинов Э. Г. Атомно-эмиссионный анализ с индукционной плазмой. Серия Аналитическая химия. – Т. 2. – Итоги науки и техники. – М.: Литература, 1990. – 255 с.