2.2.10 Исследование трансформации кислотоводорастворимого лигнина гидролизатов

лигноцеллюлозных материалов

Для исследования трансформации кислотоводорастворимого лигнина гидролизатов

использовали фермнтные препараты на основе фильтратов (супернатантов) или нативный мицелий грибов К-2, Х-1, К-21, В-1, П-1 и без грибов (контроль), которые смешивали с 0,1М ацетатным буфером рН 5,0 (или оптимальным рН для исследуемого гриба) и исследовали лакказную активность (или % трансформации КВЛ).

В результате сравнения содержания КВЛ в реакции до и после обработки гидролизата препаратами грибов (и контроля) делали вывод о степени трансформации лигноцеллюлозного материала КВЛ.

2.2.11 Исследование деградации кислотоводорастворимого лигнина гидролизатов

лигноцеллюлозных материалов

Для исследования деградации кислотоводорастворимого лигнина гидролизатов

соответствующие гидролизаты использовали в качестве субстратов (вместо глюкозы) в составе жидких питательных сред модифированной Чапека или Королевой-Скоробогатько. В результате культивирования анализировали лакказную активность и содержание КВЛ в среде культивирования грибов К-2, Х-1, К-21, В-1, П-1 и без грибов.

В результате сравнения содержания КВЛ в среде вначале и на текущий момент верени роста гриба делали вывод о степени деструции КВЛ гидролизата.

Определение содержания КВЛ в гидролизатах проводили спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм. Для удаления мешающего влияния белков использовали осаждение их с помощью 20% раствора ТХУ, для чего к 3 - 5 мл пробы приливали 0,5 - 1,0 мл раствора ТХУ.

2.2.12 Определение лигнина методом Класона в модификации Комарова

Для оценки содержания лигнина в лигноцеллюлозных материалах метод Класона в модификации Комарова. Суть метода заключается в удалении ( растворении) и/или сжигании сахаров целлюлозы, гемицеллюзы. Остаток – лигнина имеет темный цвет и нерастворим ни в каких растворителях.

Для этого навеску лигноцеллюлозного материала гидролизуют концентрированной и разбавленной серной кислотой в две ступени: сначала концентрированной кислотой при температуре около 20° С в течение 1,5 час, а затем реакционную массу разбавляют водой до 200 мл и кипятят. Остаток кислотного лигнина взвешивают и оценивают содержание лигнина, суммируя содержание КВЛ, в пробе.

Путем сравнения пробы лигноцеллюлозы, обработанной грибами, и контроля (без воздействия грибов) делали вывод о степени деструкции лигнина при воздействии лакказы исследуемых грибов.

Детальная методика определения лигнина [49] заключалась в следующем:

1) Навеску воздушно-сухих обессмоленных этиловым эфиром или спиртотолуольной смесью опилок массой около 1 г помещали в коническую колбу вместимостью 50 см3 с притертой пробкой. (Влажность обессмоленной древесины определяли в отдельной пробе).

2) К навеске добавляли 15 см³ 72%-ной H₂SО₄ (плотностью 1,64 г/см ³) и выдерживали в термостате при температуре 24 – 25°С в течение 2,5 ч при периодическом осторожном помешивании во избежание образования комков;

З) Смесь лигнина с кислотой переносили в коническую колбу вместимостью 500 мл, смывая лигнин 200 мл дистиллированной воды;

4) Разбавленную смесь кипятили с обратным холо­дильником на плитке (слабое кипение) в течение 1 ч. Частицам лигнина давали укрупниться и осесть;

5) Лигнин отфильтровывали на стеклянном пористом фильтре, высушенном до постоянной массы. Фильтрование проводили на следующий день.

Мелкодисперсные лигнины (лиственные и др.) фильтровали через стеклянный фильтр с «нафталиновой подушкой». Водно-спиртовую суспензию нафталина наливали в стеклянный фильтр, отсасывали и, промывали холодной водой с отсосом, после чего фильтровали лигнин. При замедлении фильтрования подключали водоструйный насос, но при этом не следовало отсасывать осадок на фильтре досуха. Необходимо оставлять слой воды перед добавлением каждой новой порции фильтруемой жидкости. После промывки от кислоты (по индикатору метиловому оранжевому) отсасывали жидкость полностью;

6) Для установления конца промывки каплю жидкости, стекающей с фильтра, наносили на фильтровальную бумагу и добавляли каплю индикатора. Если последний не менял цвета, промывку считали законченной;

7) Фильтр с лигнином сушили в сушильном шкафу при тем­пературе (103±2)°С до постоянной массы и взвешивали

Массовую долю лигнина, % к абсолютно сухой исходной (необессмоленной) древесине, рассчитывали по формуле:

С=(m₁-m)/g *100%,

где m₁— масса фильтра с лигнином, г; m — масса пустого фильтра, г;

g — масса абсолютно сухой навески обессмоленной древесины, г

Разность между результатами двух параллельных опреде­лений не должна превышать 0,5%

2.2.12 Определение эмульгирующей способности культуры

грибов по методу Купера

Для определения эмульгирующей активности культуры выращивали в течение 5 суток на жидкой среде Чапека. Далее отбирали 4 мл культуральной жидкости, фильтровали, центрифугировал при 6000 об/ мин в течение 15 мин. Эмульгирующую активность определяли путем добавления к 4 мл исследуемого образца 4 мл хлороформа с последующим встряхиванием в течение 10 мин. Полученную эмульсию оставляли на 24 ч при комнатной температуре. Эмульгирующую активность определяли как отношение высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в измерительной пробирке и выражали в % [31].

2.2.13. Исследованию деградации синтетических органических красителей грибами

Исследование способности исследуемых грибов к деградации синтетических красителей проводили в условиях трансформации их в качестве субстратов в ацетатном буфере рН 5,0 и ростовых условиях на среде Чапека или Королевой- Скоробогатько.

Для изучения деградации синтетических красителей в условиях трансформации концентрация составляла от 50 – 1000 мкМ в 0,1М ацетатном буфере рН 5,0. Определение концентрации белка в пробах культуральной жидкости проводили по методу Лоури [28].

Для изучения деградации синтетических красителей в условиях роста грибы выращивали на агаризованной среде Королевой-Скоробогатько (КС) в присутствии красителей (концентрация 25 мг/л) в течение 15 суток. Отмечали рост гриба и обесцвечивание красителя.

На основании данных роста (равнение диаметра колонии в опыте с красителем и без него) и снижения концентрации субстратов лакказ –синтетических органических красителей – по их обесцвечиванию можно сделать вывод о потенциале деструкции данного гриба в отношении определенного красителя.

В качестве исследуемых субстратов лакказы были исследованы гетероциклические полиароматические соединения, относимые к группе хромогенных красителей, которые под действием окислительных ферментов исследуемых грибов подвергаются обесцвечиванию:

1 Пирокатехин (1,2-диоксибензол)

2 Ремазол

3 Эриохром черный С₂₀Н₁₂Т₃О₇S Na

4 Эозин Ба (2,4,5,7-тетрабромфлуоресцеина динатриевая соль)

5 Хромовый темно-синий-

6 Хризоидин

7 Активный ярко – голубой

8 Судан Ш

9 Фуксин кислотный

10 Метиленовый синий

11 Азур I

12 Лакмоид

13 Бриллиантовый синий

14 Гематоксилин

15 Нейтральный красный

16 Легкосмываемый красный

17 Метилтимоловый синий

18 Сафранин

19 Кальцион

20 п-Нитрофенол

21 Диметиламиноазобензол

22 -нафтол

23 Бензидин основание

2.2. 14 Исследования лакказной активности грибов в присутствии лигниноподобных соединений

Для исследования лакказной активности мицелиальные грибы их выращивали на жидкой среде Чапека М в присутствии лигниноподобных соединений: резорцина (РЦ); пирогаллола (ПГ); ремазола (РМ); гидрохинона (ГХ); 2,6-диметилфенола (2,6-ДМФ) – с конечной концентрацией 5-10 мМ в течение 12 суток. Лакказную активность измеряли стандартным спектроскопическим методом [29].