Микробиологическая диагностика септических инфекций

Определение понятий

Бактериемия представляет собой фазу патогенеза общих и системных инфекционных заболеваний, выполняющую функцию передачи возбудителя другим хозяевам или переноса его в иные места локализации и выделения. На определенном этапе патогенеза возбудитель из первичного очага локализации проникает в кровь, циркулирует в ней определенный срок, значительная часть возбудителя гибнет, вызывая интоксикацию, остальные захватываются клетками лимфоидной и макрофагальной систем и уничтожаются или персистируют в них. Размножение возбудителя в крови не происходит, поскольку кровь сохраняет свои антимикробные свойства.

Фаза бактериемии закономерна при заболеваниях, передающихся кровососущими насекомыми (например, сыпном и возвратном тифах, малярии) и с помощью иных механизмов (брюшном тифе, лептоспирозе, бруцеллезе, листериозе, менингококковой инфекции). Она нередко осложняет течение тяжелых форм инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами. В этих случаях бактериемия часто переходит в сепсис.

Кратковременная (транзиторная) бактериемия возможна при голодании, переутомлении, перегревании, переохлаждении, травмах, некоторых медицинских вмешательствах (при удалении зубов, абортах, оперативных вмешательствах на инфицированных органах, иммуносупрессивной терапии и др.).

Сепсис - это тяжелое генерализованное самостоятельное острое или хроническое инфекционное заболевание крови, обычно развивающееся на фоне глубокого иммунодефицита или сенсибилизации организма к антигенам возбудителя. Единственным или главным местом обитания и размножения возбудителя при сепсисе является кровь. В настоящее время наблюдается тенденция нарастания заболеваемости сепсисом и утяжеления его течения, что связывают с увеличением среди стационарных больных лиц с иммунодефицитами, широким распространением больничных штаммов условно-патогенных микробов и другими причинами, обусловившими рост числа оппортунистических инфекций. Выделяют две формы сепсиса: септицемию и септикопиемию.

При септицемии (первичном сепсисе) возбудитель сразу из входных ворот проникает в кровь, размножается в ней и вызывает сепсис. Первичный локальный очаг воспаления отсутствует, вторичные метастатические очаги нередко развиваются. Септикопиемия (вторичный, метастатический сепсис) возникает в результате генерализации локального инфекционного процесса. В зависимости от первичного локального очага, точение которого осложнилось сепсисом, выделяют раневой, послеродовый, пупочный, урогенный, стоматогенный, отогенный, ожоговый, генитальный и другие формы сепсиса. Сепсис часто развивается при тяжелых формах перитонита, менингита, при политравмах с шоком и большой потерей крови, при инфекционных процессах у новорожденных, у пожилых людей, у больных болезнями крови, декомпенсированными формами диабета, СПИДом, в предмортальный период многих болезней. Широко используются в учении о сепсисе понятия хирургический, внутрибольничный, острый и хронический сепсис.

Для сепсиса, в отличие от бактериемии, характерны утрата кровью антимикробных свойств и, как следствие этого, размножение возбудителя в крови, сочетание признаков инфекции, микробной интоксикации и повышенной реактивности организма, характерная температурная кривая, склонность к образованию вторичных очагов инфекции, геморрагический синдром, потеря веса, тахикардия, отсутствие наклонности к самовыздоровлению и положительной динамики в первичном очаге. Исход сепсиса тяжелый

Этиология

Сепсис относится к полиэтиологичным заболеваниям. Ранее главным возбудителем сепсиса был S.pyogenes. В настоящее время в этиологии большинства форм сепсиса ведущее место занимают S. epidermidis и S. aureus , далее следуют E.coli, Proteus sp., К. pneumoniae и другие условно-патогенные виды энтеробактерий, P. aeruginosa, Streptococcus pyogenes, pneumoniae, faecalis, Bacteroides sp., Acinetobacter sp., Candida albicans. Описаны случаи сепсиса, вызванные многими другими видами условно-патогенных микробов. Обычно сепсис вызывается каким-либо одним видом микроба, но примерно в 7-10% случаев его причиной является ассоциация из двух и даже трех возбудителей.

Этиологическая структура септикопиемии значительной мере отражает структуру возбудителей первичных очагов воспаления, которые осложнились сепсисом. Например, раневой сепсис чаще вызывается стафилококками, урогенный - грамотрицательными бактериями, стоматогенный - аспорогенными анаэробами, ожоговый - синегнойными бактериями. Однако в конкретных случаях видовой состав микробов, выделенных из крови и первичного очага, нередко не совпадает, что связывают с несовершенством методических приемов и сменой микрофлоры первичного очага в процессе болезни.

Ведущее значение в развитии сепсиса принадлежит недостаточности иммунной системы, особенно ее неспособности локализовать возбудителя в месте первичного очага, но вероятность развития сепсиса также резко повышается при попадании в кровь больших количеств возбудителя и высокой его вирулентности. Штаммы, выделенные из крови больных сепсисом, часто относятся к больничным штаммам или эковарам, обладающим не только более высокой вирулентностью, но и множественной устойчивостью к антибиотикам.

Микробиологическая диагностика

Клиническая картина разных этиологических форм сепсиса идентична или близка. Поэтому в диагностике сепсиса и особенно в определении тактики химиотерапии решающая роль принадлежит микробиологическому исследованию.

Бактериоскопический метод, как правило, не применяется. Лишь в отдельных случаях используется микроскопия толстой капли крови (например, при менингококковом сепсисе).

Бактериологический метод является основным методом диагностики. Он проводится путем выделения возбудителя из крови (гемокультура), а при септикопиемии вспомогательное значение для постановки диагноза имеет выделение культуры из первичных и вторичных локальных инфекционных очагов. В большинстве случаев, особенно при бактериемии, микробы находятся в крови в небольших количествах, в связи с чем вероятность их выделения нарастает с увеличением посевной дозы, при повторных исследованиях (при острых процессах - 2-3 раза, хронических - 5-6 раз), заборе материала в период подъема температуры, до начала химиотерапии. Присутствующие в крови пенициллины могут быть нейтрализованы добавлением пенициллиназы, сульфаниламиды - перааминобензойной кислоты. Для устранения антимикробного действия сывороточных белков кровь засевают в большие объемы сред в соотношении 1:5-1:10.Кровь забирают из локтевой вены в количестве 5-10 мл с соблюдением правил асептики и засевают ее на питательные среды сразу же или спустя короткое время. В последнем случае к крови добавляют цитрат или оксалат натрия, гепарин.

Для выявления бактериемии, которая наблюдается при многих инфекционных заболеваниях, применяют специальные методы исследования. Например, при брюшном тифе, паратифах сальмонеллезе 5-10 мл крови засевают на среду Раппопорт или желчный бульон (в колбы с 50-100 мл среды) и инкубируют в аэробных условиях.

Выбор питательных сред и условий культивирования зависит от вида, предполагаемого возбудителя. Рекомендуется производить посев на несколько питательных сред, чтобы обеспечить возможность роста максимально большему числу возможных возбудителей. По меньшей мере следует использовать две среды: "двойную среду" и "среду для контроля стерильности". Оправдан также посев на полужидкую среду Тароцци и жидкую среду Сабуро. Процент положительных исследований повышается при использовании оригинальной "среды со стаканчиком", что обеспечивает культивирование после предварительного лизиса форменных элементов крови. При этом методе происходит высвобождение микроорганизмов, адсорбированных на эритроцитах или подвергшихся незавершенному фагоцитозу. Посев гемолизированной крови позволяет выявить бактериемию в ряде случаев, когда на других средах роста нет.

Среды для первичного посева:

1. «Двойная среда», состоящая из скошенного во флаконе 150 мл питательного агара и 150 мл полужидкой среды, приготовленной на питательном бульоне с добавлением 15 г глюкозы и 0,15 г агара. Кровь засевают в жидкую часть среды. Инкубируют в термостате при 37 °С. Флаконы ежедневно просматривают, при этом, наклоняя флакон смачивают поверхность скошенного агара бульоном. Это исключает необходимость высева на плотные питательные среды и, следовательно, уменьшает риск загрязнения при пересевах.

2. «Среда для контроля стерильности». Эту среду следует обогатить, добавив дрожжевой экстракт до 20 г на 1 литр (не менее 15 г) и агар до 5 г на 1 литр (не менее 4,25 г). Добавляют к среде 0,001 г резазурина — индикатора кислорода. Анаэробные условия контролируют по розовому окрашиванию среды. При покраснении более 20% столбика среды можно ее регенерировать на водяной бане в течение 20 минут при 100°C. Однако, эту операцию можно производить только один раз. Среда дает возможность получить рост некоторых анаэробных и полуанаэробных микроорганизмов.

3. «Среда со стаканчиком» - для предварительного лизиса форменных элементов крови. Для приготовления этой среды во флаконы с широким горлом (диаметром 30 мм), емкостью 250 мл наливают 50 мл дистиллированной воды, содержащей 0,1% агара. В этот флакон пинцетом опускают стеклянный стаканчик или пробирку длиной 70 мм и диаметром 20-22 мм, в которой находится 12 мл концентрированной питательной среды: (состав: на 100 мл перевара Хоттингера с остаточным азотом 750—800 мг%, 2 г глюкозы, 2 г хлористого натрия, рН 7,5—7,4). Стерилизуют 30 минут при 0,5 атм. Для получения гемокультуры в «среде со стаканчиком» в агаризованную воду помещают 3—5 мл крови. Оставляют флакон при комнатной температуре на 30—40 минут для гемолиза форменных элементов крови. Затем, наклоняя флакон, выливают содержимое стаканчика в водный раствор с кровью, флакон ставят в термостат. Посев гемолизированной крови позволяет выявить бактериемию в ряде случаев, тогда, когда на других средах роста нет. Высвобождение микроорганизмов, адсорбированных на эритроцитах или подвергшихся незавершенному фагоцитозу, а также снижение антибактериальной активности гемолизированной крови, делает эту среду особенно ценной при заболевании, для которого характерна незавершенность фагоцитарной реакции.

4. Полужидкая среда Тароцци с 0,5% глюкозы и 0,1% агара во флаконах по 300 или 150 мл. Во флаконы сеют 5 мл и 3 мл крови (соответственно количеству среды).

5. Жидкая среда Сабуро служит для выявления грибковых септических состояний. Приготовление: на 1 литр дистиллированной воды берут 10 г пептона, 25 г хлористого натрия, 40 г глюкозы. Разливают во флаконы по 150—200 мл, стерилизуют при 0,5 атм. 20 минут (рН 5.5).В жидкую среду Сабуро засевают 3—4 мл крови.

Засеянные кровью среды инкубируют в течение 6 недель в термостате при 37°С. Просматривают ежедневно в течение первых 8 дней. При появлении видимого роста делают мазки, окрашивают их по Граму, выделяют на соответствующих средах чистую культуру, проводят ее идентификацию и определяют чувствительность к антибактериальным препаратам. При отсутствии роста на 9-10 день дают отрицательный ответ. Однако флаконы с засеянной средой не выбрасывают, их держат в термостате до 4-6 недель (в расчете на замедленный рост персистирующих бактерий, бактерий в L-форме и т.д.), проверяя появление роста 2-3 раза в неделю.

Выделение из крови как облигатно-патогенных, так и условно-патогенных микробов, независимо от их количества, расценивается как бактериемия или сепсис. Такой подход вытекает из того, что кровь здоровых людей, за редким исключением, микробов не содержит (стерильна). Заключение становится более надежным в случаях повторного выделения аналогичной культуры, а также изоляции ее из локальных очагов воспаления. Как указано выше, выделенные культуры обязательно испытываются на чувствительность к антибактериалъным препаратам.

Серологическая диагностика может быть использована как вспомогательный метод и проводится путем постановки реакции агглютинации с аутогемокультурой. В отдельных этиологических формах сепсиса с помощью серологических реакций могут быть обнаружены циркулирующие в крови видовые антигены.

При постановке диагноза сепсис, а также дифференциации бактериемии и сепсиса при отрицательных данных лабораторного исследования необходимо опираться на клинические данные.

Наряду с установлением возбудителя сепсиса следует обязательно исследовать иммунный статус больного, так как исход сепсиса зависит не только от рациональной химиотерапии, но и от применения средств, нормализующих функцию иммунной системы организма.