V(d)j-рекомбінація імуноглобулінових генів

Транспозиції мобільних елементів

ДНК-транспозони

LTR-ретропозони

Мобільні елементи LINE та SINE

Розділ 11. Методи молекулярної біології

Клонування, ампліфікація і секвенування днк

Клонування ДНК

Гель-електрофорез

Створення та скринінг геномних бібліотек

Полімеразна ланцюгова реакція

Секвенування ДНК

Біоінформатика

Експрессія рекомбінантних білків

Методи аналізу структури й експресії генів та геномів

Блот-гібридизація

Визначення стартових та кінцевих точок і рівня активності транскрипції

Аналіз експресії геному

Методи дослідження ДНК-білкових взаємодій

Гель-електрофорез білково-нуклеїнових комплексів

Футпринтинг

Імунопреципітація хроматину

Фізичні методи дослідження структури та активності біомакромолекул

Методи безпосереднього спостереження

Рентгено-структурний аналіз

Дослідження структури макромолекул у розчині

Методи дослідження окремих макромолекул

Предметний покажчик

Передмова

Ця книга має на меті познайомити студентів біологічних факультетів із сучасними уявленнями про молекулярні механізми найбільш загальних біологічних процесів. В основу книги покладено курс молекулярної біології, що читається на біологічному факультеті Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Книга передбачає попереднє ознайомлення читача з основами цитології та біохімії.

Якщо визначити молекулярну біологію як розділ біологічних наук, який присвячено з'ясуванню молекулярних механізмів біологічних процесів, то сьогодні майже вся біологія є молекулярною або, принаймні, прагне бути такою. Але у більш вузькому сенсі під молекулярною біологією традиційно розуміють вивчення молекулярних механізмів процесів передачі та реалізації спадкової інформації – найбільш загальних процесів, що відбуваються в усіх живих системах. Цей підручник виходить саме з такого розуміння (ключовими при цьому є слова “молекулярні механізми“), яке дозволяє відокремити молекулярну біологію як учбову дисципліну від біохімії, біофізики, генетики та фізіології. З іншого боку, оскільки загальні принципи функціонування біологічних макромолекул є універсальними, підручник може розглядатися як базовий для подальшого вивчення інших біологічних процесів на молекулярному рівні.

Усі підручники можна розділити на дві групи: посібники великого об'єму, які містять вичерпно повний набір відомостей щодо певної галузі і можуть бути використані у якості довідника, і стислі підручники, що дають уявлення про базові принципи відповідної наукової дисципліни. Ця книга є підручником другого типу. Основна увага приділяється принципам структурної організації біологічних макромолекул та взаємодій між ними, що лежать в основі здійснення біологічних функцій.

Сподіваюся, що книга буде корисною не тільки для студентів, а і для аспірантів та науковців, біологів, медиків, аграріїв, а також фізиків та хіміків, які цікавляться молекулярною біологією.

Щиро дякую ...

А.В. Сиволоб

Вступ

Найбільш загальними, спільними в основних своїх рисах для усіх живих систем, процесами, що лежать в основі функціонування організмів, є процеси збереження та реалізації спадкової інформації.

Магістральний шлях передачі інформації у біологічних системах відображає схема, що була запропонована у свій час Френсісом Кріком під назвою центральна догма молекулярної біології:

Формулювання центральної догми можна вважати початком молекулярної біології як окремої науки, і саме за цією схемою, не порушуючи певну традицію, побудована ця книга.

Вузловими точками схеми – джерелом та об'єктами передачі інформації – є біологічні макромолекули двох основних типів: нуклеїнові кислоти та білки. Приставка “макро-“ відображає той простий факт, що молекула має великий розмір – не характерний для “звичайних“ молекул неорганічного світу. Великий розмір біологічних макромолекул є принциповою відмінністю живих систем: тільки молекула, що складається з великої кількості атомів, здатна мінімізувати перешкоджаючий вплив випадкових теплових флуктуацій і здійснювати більш-менш точні операції на основі численних взаємодій з іншими молекулами. Перший розділ книги присвячено розгляду деяких важливих фізико-хімічних принципів, які є основою молекулярної біології.

Макромолекули – це полімерні ланцюги, що складаються із мономерних хімічних груп певного класу. Кінцевою точкою передачі біологічної інформації є білки (або протеїни) – біополімери, побудовані з 20 типів амінокислот. Велике розмаїття амінокислотних послідовностей створює можливості для реалізації різноманітних шляхів укладки ланцюгів у просторі – утворення специфічних просторових структур білків для виконання певних специфічних завдань. Головним типом цих завдань є каталіз численних біохімічних реакцій (у тому числі тих, що забезпечують передачу біологічної інформації). Здійснення реакцій, що мають відбуватися у вузькому діапазоні фізіологічних умов, було б практично неможливим без такого каталізу. Крім того, білки є основним будівним матеріалом будь-якої біологічної системи та забезпечують виконання усіх інших біологічних функцій: транспорт речовин, передачу регуляторних сигналів, спрямовані рухи частин системи, захист від чужорідних молекул тощо. Принципи структурної організації білків та їх функціонування розглядаються у розділі 2.

Мономерами нуклеїнових кислот є нуклеотиди: нуклеотиди чотирьох типів утворюють полінуклеотидний ланцюг, два такі ланцюги, утримуючись разом за рахунок певних взаємодій, формують дволанцюгову спіральну молекулу дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). Нуклеотиди, що трохи відрізняються за хімічною будовою, утворюють (як правило, одноланцюгову) полімерну молекулу рибонуклеїнової кислоти (РНК). Молекула ДНК відрізняється високою стабільністю, що робить її чудовим засобом збереження спадкової інформації. Сама інформація записана у вигляді послідовності нуклеотидів чотирьох типів, а структура дволанцюгової молекули забезпечує функціонування ДНК як носія інформації. Ключовим у цьому відношенні є так званий принцип комплементарності, згідно якого чотири нуклеотиди розбиваються на дві комплементарні пари, і ДНК є стабільною тільки за умови, що в двох ланцюгах один проти одного стоять нуклеотиди однієї такої пари. Таким чином, кожен з ланцюгів є своєрідним дзеркальним відображенням іншого. Структурна організація ДНК та принципи її взаємодії з білками, що забезпечують упаковку ДНК у клітині та регуляцію її активності, описані у розділі 3. Особливості різних типів РНК, що виконують різноманітні важливі допоміжні функції у процесах реалізації спадкової інформації, розглядаються окремо у розділах, присвячених механізмам відповідних процесів.

Спадкова інформація, що записана у послідовності нуклеотидів на ділянці ДНК, є, власне, інформацією про послідовність амінокислот у складі білка. Окрема змістовна ділянка ДНК, у послідовності якої закодована амінокислотна послідовність білка, називається геном. Сукупну нуклеотидну послідовність ДНК в клітинах певного організму (яка включає гени, з'єднані міжгенними зонами) називають геномом. Розділ 4 присвячено загальним принципам організації геномів, а також упаковки ДНК в клітинах – у складі ДНК-білкового комплексу, який називають хроматином. У цьому ж розділі описано систему співвідношень між елементами послідовності нуклеотидів та амінокислотними послідовностями білків – генетичний код, що використовується живими системами для перекладу нуклеотидного тексту в послідовність амінокислот у складі білка.

Наведене вище визначення гена є, насправді, не зовсім точним. Крім білкових генів, геном кожного організму містить також гени, кінцевими продуктами яких є різноманітні молекули РНК. Але незалежно від типу гена, первинним продуктом його активності (проміжним для білкових генів) є молекула РНК. Під час транскрипції нуклеотидна послідовність одного з ланцюгів ДНК за принципом комплементарності переписується у нуклеотидну послідовність РНК – ДНК використовується як матриця, на якій будується комплементарна РНК-репліка. Молекула РНК, що синтезується на білковому гені, використовується далі як матриця для білкового синтезу (матрична або інформаційна РНК – мРНК). Молекулярні механізми транскрипції та її регуляції у про- та еукаріотів розглядаються у розділах 5 та 6. Тісно пов'язаний із транскрипцією процесинг еукаріотичних мРНК (остаточне “дозрівання“ функціонально-активної молекули) розглянуто в розділі 7.

Розділ 8 присвячено молекулярним механізмам кінцевого етапу експресії білкових генів – синтезу білків. Матрицею для білкового синтезу є молекула мРНК, нуклеотидна послідовність якої за правилами генетичного коду перекладається в амінокислотну послідовність білка під час трансляції. При цьому знов використовується принцип комплементарності: елемент послідовності мРНК впізнається комплементарною ділянкою у складі особливої молекули РНК – транспортної РНК (тРНК), яка несе на собі амінокислоту. Специфічне зв'язування певної тРНК з відповідною амінокислотою є, таким чином, важливою передумовою трансляції. Процес сканування матриці та синтезу амінокислотного ланцюга забезпечується рибосомою – мультимолекулярним комплексом, основою якого є рибосомні РНК (рРНК), зв'язані з рибосомними білками. Після закінчення синтезу на рибосомі амінокислотного ланцюга відбувається його просторове укладання у специфічну білкову структуру. Закономірності цього процесу також розглянуто у розділі 8.

Суттєвим моментом функціонування живої системи є не тільки реалізація (експресія) генетичної інформації, а й її збереження та подвоєння з метою передачі наступному поколінню. Подвоєння інформації – це відтворення молекули ДНК у двох ідентичних дочірніх копіях – реплікація. Головним механізмом реплікації є вже згаданий кілька разів принцип комплементарності: кожен з ланцюгів ДНК використовується як матриця для синтезу комплементарної ДНК-репліки. Спеціальні молекулярні системи забезпечують високу точність синтезу ДНК під час реплікації. Процеси виправлення помилок, які все ж таки виникають під час реплікації, а також пошкоджень у молекулі ДНК, що з'являються під дією зовнішніх впливів, об'єднують під назвою репарації ДНК. Молекулярним механізмам реплікації та репарації присвячено розділ 9. У розділі 10 розглянуто молекулярні процеси, що призводять до надзвичайно біологічно важливої перетасовки генетичного матеріалу – рекомбінації ДНК.

В останньому 11 розділі дається огляд деяких найбільш важливих методів дослідження, що використовуються у молекулярній біології.

Як це зазвичай прийнято робити у підручниках, з метою полегшення сприйняття у тексті відсутні посилання. Перелік рекомендованої літератури наведено наприкінці кожного розділу. Перелік літератури, наведений нижче, можна вважати загальним до курсу в цілому.

Зображення структур макромолекул, якими проілюстровано книгу, створено на основі атомних координат з Банку даних білкових структур (PDB – Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/, відповідні коди PDB наведено у підписах до рисунків) за допомогою програмних пакетів PyMOL (http://www.pymol.org/) та UCSF Chimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera).