Резюме по теме

Оптическая микроскопия, имея пределы разрешения, зависящие от длины световой волны и точности обработки линз, позволяет изучать биологические объекты размером не менее 0,5 мкм. Использование красителей и различного рода контрастов расширяет возможности световых микроскопов. Применение в качестве источника освещения лазеров позволяет получить оптические сечения и послойные изображения исследуемых объектов, что важно для оценки геометрических характеристик клеток и субклеточных структур. Обработка препаратов специальными веществами (индикаторы, флуорохромы, трассеры и др.) обеспечивает выявление особенностей биохимической организации и изменений молекулярного состава живых систем.

Раздел 2 электронная микроскопия

Рис. 30. Современный просвечивающий (с лева) и растровый электронные микроскопы (с права) фирмы ZEISS.

Тема 2.1 Просвечивающая электронная микроскопия

Цели и задачи изучения темы

Цель: формирование знаний об использовании просвечивающих электронных микроскопов в биологических исследованиях.

Задачи:

• изучение принципов работы и устройства, просвечивающих электроных микроскопов;

• оценка возможностей использования просвечивающей электронной микроскопии в изучении морфологической организации клеток и субклеточных структур.

Просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия (ПЭМ) использует волновые свойства движущихся электронов с целью получать изображения изучаемого объекта с высоким разрешением. Электроны, вылетающие из электронной пушки, проходят через конденсорные линзы, которые фокусируют электроны на объекте. Пучок электронов проходит сквозь образец. Линзы объектива и линзы проектора увеличивают прошедший луч и проецируют его на люминесцентный экран. Удары электронов возбуждают экран и создают видимое увеличенное изображение образца. Изображение регистрируется различными детекторами. Пространственное разрешение ПЭМ достигает 0,1 нм (1 Ǻ) при ускоряющем напряжении 50—600 кВ.

.

Рис. 31. Общая схема просвечивающего электронного микроскопа.

Обычными источниками электронов являются термоионные электронные пушки или пушки автоэлектронной эмиссии.

Рис. 32. Термоионная электронная пушка.

Большое значение в ПЭМ имеют яркость и интенсивность источника электронов. Яркость - плотность тока в единице телесного угла. Интенсивность источника - число испускаемых электронов за единицу времени, отнесенное к единице площади излучающей поверхности, т.е плотность эмитируемого тока.

Для пучка света, проходящего сквозь оптическую систему, произведение площади на пространственный апертурный угол остается величиной постоянной. Таким образом, используя лишь большой апертурный угол оптической системы, крупный источник можно сфокусировать в небольшое пятнышко. Но поскольку апертурные углы у электронных линз ограничены, то для того, чтобы получить яркое изображение образца, требуются источники малого размера и высокой яркости.

Важнейшей частью ПЭМ являются электронные линзы. Линзы используются для собирания лучей исходящих из точки объекта и создают точку в изображении, а также для фокусирования лучей в точку на фокальной плоскости линзы. Существуют линзы магнитные, электростатические и линзы смешанного типа. Некоторые характеристики, такие как фокусная длина, сферическая аберрация и хроматическая аберрация, практически одинаковы у электронных и оптических линз.

Сферическая аберрация. Этот дефект связан с неидеальным действием на лучи, идущие вдали от оптической оси. Чем дальше от оси движется электрон, тем сильнее он отклоняется по направлению к оси. В результате точка изображается в виде диска конечного размера.

Хроматическая аберрация. Этот дефект связан с немонохроматичностью электронов, и с разным отклонением в электромагнитном поле электронов, отличающихся энергией. Электроны с более низкими энергиями, отклоняются на больший угол. При таком энергетическом разбросе хроматическая аберрация не представляет проблему. Однако вследствие неупругих процессов спектр электронов «размывается» после прохождения образца.

Астигматизм - поле в межполюсном зазоре электромагнитных линз должно быть идеально аксиально симметричным. Из-за неточностей в профиле сердечника из магнитомягкого железа и его полюсных наконечников аксиальная симметричность поля нарушается. Неоднородность химического состава магнитомягкого материала также приводит к возмущениям магнитного поля. Апертура может располагаться также не идеально в центре. Многочисленные причины астигматизма приводят к размытию точки в диск. Астигматизм можно скорректировать, используя стигматоры, которые представляют собой небольшие октупольные линзы, поле которых компенсирует неоднородности поля основной линзы. Стигматоры имеются в конденсорной и объектной линзах.

Изображение или дифракционная картина в ПЭМ - это двухмерные распределения интенсивности электронов, получающиеся в результате взаимодействия электронов с образцом.

Люминесцентный экран обычно покрыт составом типа ZnS, испускающим свет с длиной волны 450нм, а при введении соответствующих примесей - около 550нм, наиболее благоприятный свет для глаз. Размер зерен ZnS от 10 до 50 мкм, чтобы глаз не различал их.

Для регистрации электронов используются 2 типа детекторов: полупроводниковый детектор и система сцинтиллятор-фотоумножитель. Помимо традиционных фотопластин и фотопленок, для регистрации изображений и дифракционных картин в ПЭМ используют ТВ-камеры и ССД-камеры (CCD - charge-coupled device), которые позволяют видеть и анализировать изображение в режиме on-line.

Вакуумная система ПЭМ. В ПЭМ постоянно поддерживается высокий вакуум, давление внутри колонны ~10^-7торр (1.3 10-⁵ Па), В ПЭМ применяют следующие виды вакуумных насосов: форвакуумный (mechanical - rotary - roughing pump), диффузионный (diffusion), турбомолекулярный (turbomolecular) и ионный или электроразрядный (ion) насосы.

1. Форвакуумный насос используется для получения чернового вакуума. Необходимо предпринимать меры, чтобы механические вибрации, сопутствующие работе этого насоса не передавались на инструмент. Кроме того, трубопроводы, соединяющие насос с микроскопом, должны иметь эффективно работающие ловушки (конденсирующие или адсорбирующие) для паров масла, являющегося рабочей жидкостью в форнасосах.

Рис. 33. Общая схема форвакуумного (А) и диффузионного насоса (Б).

Выхлопные газы должны выводиться из рабочего помещения.

2. Диффузионный насос. Рабочей средой является синтетические масла (полиэфирные) с низким давлением насыщенных паров. Для дальнейшего подавления проникновения паров в вакуумную систему используют охлаждаемые жидким азотом ловушки, разделяющие диффузионный насос и ПЭМ. Диффузионные насосы способны обеспечивать вакуум в диапазоне от ~10^-1-10^-9Па (10^-11 торр).

3. Турбомолекулярный насос. Основной его частью является турбина, вращающаяся со скоростью 10000-50000 оборотов в минуту. Такие насосы не содержат масла, практически бесшумны и не создают вибрации. Турбомолекулярный насос может стартовать с атмосферного давления, медленно разгоняясь по мере улучшения вакуума, что важно для UHV систем, т.к. она становится безмаслянной.

4. Электроразрядный (ионный) насос. Не содержит масла, поэтому не загрязняет ПЭМ. Не создает вибрации. Принцип работы: титановый катод испускает электроны, которые движутся по спирали в магнитном поле, и ионизируют молекулы воздуха. Ионы в свою очередь притягиваются катодом и распыляют материал катода. Распыленные атомы Ti конденсируются, главным образом, на цилиндрическом аноде, захватывая при этом молекулы остаточного газа. Остаточные газы поглощаются по двум каналам: путем хемосорбции на поверхности анода и путем электрического притягивания ионов газа к катоду. Чем ниже вакуум, тем меньше ионный ток, т.о. насос одновременно является измерителем (по величине ионного тока) давления. Однако ионный насос эффективен при низком давлении (<~10^-3Па = 10^-5торр). Он, как правило, откачивает область электронной пушки.

Рис. 34. Общая схема турбомолекулярного (А) и ионного насоса (Б).

Держатель образцов. Исследуемый образец крепится на держателе (specimen holder) и транспортируется через шлюз гониометра в поле объектной линзы. Держатель обеспечивает перемещение образца по осям и его вращение. Держатель может быть снабжен устройством нагрева, охлаждения, механических нагрузок и одновременно обеспечивает высокий вакуум. В современных ПЭМ наиболее часто используются держатели с боковой загрузкой. Они дают возможность большей свободы механической манипуляции образцом и реализации in-situ исследований эволюции физическо-химических свойств образца.

Рис. 35. Держатель образцов.