Образование каллуса

Процесс перехода к каллусному росту в базальной части апекса начи­нается с остановки клеточных делений. Лаг-фаза продолжается 24—48 ч. В течение этого времени клетки увеличиваются в размерах и ткань раз­рыхляется. После лаг-фазы клетки начинают быстро делиться, образуя каллусную ткань.

Переход клетки in vitro из дифференцированного состояния к дедиф-ференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигеномной изменчивостью). Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом со­ставе клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характер­ные для фотосинтезирующих клеток листа. У двудольных растений про­цесс репрессии и дерепрессии генов, лежащий в основе дедифференцировки, происходит легче, чем у однодольных.

Рис. 3.1. Получение культуры каллусной

ткани из различных эксплантов:

фрагментов стебля, корня, листа,лепестков, тычинок

. Модельная кривая ростового

цикла при периодическом

выращивании каллусных тканей. Фазы

роста:

/ — латентная; 2 — логарифмическая; 3 — линейная; 4 — замедления; 5 — стационарная

При переходе дедифференцированной клетки к неорганизованному анархическому размножению, приводящему к образованию каллусной ткани, в клетках происходят биохимические и цитологические измене­ния.

Дедифференцировка начинается с использования запасных веществ и разрушения специализированных клеточных органелл.

Через 6—12 ч после индукции дедифференцировки клеточная стенка разрыхляется и разбухает, увеличивается число свободных рибосом, число элементов ап­парата Гольджи, а также размеры и число ядрышек. Все эти изменения предшествуют началу делений, которые начинаются через 48—72 ч.

Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к деле­нию и отмирания каллусных клеток, первичный каллус, возникающий на эксплантах, через 4—6 недель переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет.

Ростовая кривая каллусных клеток имеет S-образную форму. Такой характер роста легко обнаружить у суспензиозных культур каллусных клеток. Кривая роста включает пять фаз.

Во время 1-й латент­ной или лаг-фазы увеличения числа или массы клеток не происходит. Клетки в этот период подготавливаются к делениям.

Следующая, 2-я фаза — логарифмическая или экпоненциального роста — характеризует­ся наибольшей митотической активностью и увеличением массы каллус­ной культуры, кроме того, рост происходит с ускорением.

3-я фаза — линейная, в которой скорость роста клеток постоянна.

Далее наступает 4-я фаза — замедленного роста, когда митотическая активность клеток резко снижается.

В 5-й — стационарной фазе — ростовая кривая выходит на плато. В этот период начинается деградация клеток, однако она еще урав­новешивается возрастанием числа клеток за счет их деления; в целом же скорость нарастания клеточной массы равна нулю. После стационарной фазы наступает отмирание (деградация) клеток, во время которой число и масса живых клеток уменьшается.

Особенности каллусных клеток.

1. Каллусные клетки in vitro сохраня­ют многие физиолого-биохимические черты, свойственные нормальным клеткам, входящим в состав растительного организма.

2. Каллусные клетки сохраняют способность к синтезу вторичных метаболитов. Морозостой­кость и способность к закаливанию присущи каллусным клеткам, полу­ченным от морозостойких растений.

3. Общим у каллусных и нормальных клеток растения является и еще ряд признаков, в частности, устойчивость к действию высоких темпера­тур, осмотически активных веществ, засолению.

Вместе с тем каллусные клетки обладают отдельными свойствами, отличающими их от нормальных.

1. В них появляются специфические бел­ки и уменьшается количество белков, характерных для фотосинтезирующих клеток листа, или они совсем исчезают.

2. Каллусные клетки отлича­ются большой генетической гетерогенностью и физиологической асинхронностью.

В результате выхода из-под контроля организма рост каллусных кле­ток происходит неорганизованно, асинхронно, и является неограничен­ным.

3. Клеточный цикл у каллусных клеток более длительный, чем у расте­ний, произрастающих в открытом грунте.

4. Особенностью каллусных клеток является гетерогенность по возрас­ту. В каллусной ткани одновременно присутствуют клетки молодые в Gi-фазе, старые в Gi- и S-фазах цикла клеточных делений.

5. Значительные отличия наблюдаются в энергетическом обмене кал­лусных клеток. Они потребляют меньше кислорода по сравнению с нор­мальными. Еще в 1938 г. Рамсгорн обнаружил такую же особенность у меристематических клеток, следовательно, это свойство активно деля­щихся клеток. Дыхательный коэффициент (Д.К) каллусных клеток более 1.

6. Митохондрии в каллусных клетках так же, как и в меристематиче-ских, являются слабо развитыми, в них мало крист, что не может не ока­зывать влияния на активность аэробного дыхания.

7. Наряду с изменением характера дыхания в каллусных клетках в на­правлении усиления бескислородного расщепления углеводов происхо­дит также сдвиг в сторону пентозофосфатного пути, который является ис­точником пентоз, необходимых для делящихся клеток.

Физиологическая асинхронностъ — наиболее важное свойство не­половой популяции. Оно заключается в том, что в каждый дан­ный момент времени клетки находятся в разных фазах роста: одни делятся, другие растут, а третьи уже стареют. Поэтому общее фи­зиологическое состояние такой популяции принято оценивать по состоянию большинства клеток.

Причины возникающей асинхронности весьма разнообразны:

1. Особенности вида, сорта, генотипа индивидуального расте­ния, а также особенности экспланта.

2. Стрессы культивирования, например неоптимальная для дан­ного вида клеток среда.

3. Изменение баланса эндогенных гормонов и концентрации в среде экзогенных гормонов в течение выращивания.

1. Генетическая гетерогенность клеток и клонов.

2. Аномалия митотического цикла клеток in vitro.

3. Физические факторы (температура, свет, аэрация).

Генетическая гетерогенность — свойство клеток соматической популяции (нестабильность генома и их генетическая гетероген­ность). Генетически стабильными считаются только клетки меристематических тканей. В клетках остальных тканей при куль­тивировании могут возникать полиплоидия, анеуплоидия, хро­мосомные аберрации, генные мутации. Однако генетическую ге­терогенность нельзя рассматривать как недостаток, так как она является необходимым условием существования популяции кле­ток и служит основой для их адаптации.

В качестве причин появления генетической гетерогенности можно назвать следующие:

1. Генетическая гетерогенность исходного материала. В растени­ях клетки характеризуются различной плоидностью, диплоидны только активно делящиеся меристематические клетки.

2. Нарушение коррелятивных связей при выделении первичного экспланта из растения.

3. Действие компонентов среды. Экзогенные гормоны и стиму­ляторы могут оказывать мутагенное действие. Ауксины, особенно 2,4-D, входящие в состав питательных сред, — мутагены; цитокинины способствуют полиплоидизации клеток.

4. Длительное субкультивирование, при котором накапливают­ся генетически измененные каллусные клетки.

После 5 — 6 пересадок новый кариотип клеточной популяции, как правило, стабилизируется, если условия культивирования остаются постоянными. В противном случае изменение физичес­ких или трофических факторов приведет к новым генетическим изменениям.

Гормоннезависимостъ. Хотя гормоны и вызывают мутации, кал­лусные ткани от большинства растений образуются только в при­сутствии в питательной среде и ауксинов, и цитокининов.

При длитель­ном культивировании практически у всех тканей может возникать специфическое свойство гормоннезависимости, т.е. автономности по отношению к ауксинам и цитокининам. Эти ткани могут расти на среде без гормонов, что делает их похожими на опухолевые клетки и резко отличает от нормальных каллусных тканей. Внешне же та­кие гормоннезависимые ткани ничем не отличаются от каллусных. Клетки, которые в процессе культивирования приобрели свой­ство автономности от присутствия в среде гормонов, называются «привыкшими».

Генетика каллусных клеток.

Длительное время считали, что кал-лусные клетки генетически строго однородны. Однако в 60-х годах было выяснено, что клетки каллусной ткани обладают выраженной генетиче­ской гетерогенностью. Генетическая неоднородность каллусных клеток выражается прежде всего в различной плоидности, т. е. каллусные клетки отличаются по числу хромосом. Генетически стабильными in vitro явля­ются меристематические ткани.

В каллусных и суспензионных культурах встречаются клетки, имею­щие диплоидный набор хромосом, свойственный исходному растению, полиплоидные клетки, содержащие 3,4,5 и более хромосомных наборов. Наряду с полиплоидией в культуре каллусных тканей можно нередко на­блюдать анеуплоидию (возрастание или уменьшение хромосомного на­бора на несколько хромосом). Чем длительнее культивировать каллусные клетки, тем больше они различаются по плоидности. В каллусных клет­ках табака через четыре года культивирования совсем не остается дипло­идных клеток: все клетки становятся полиплоидными или анеуплоидными.

Кроме изменения плоидности, культивирование клеток и тканей рас­тений in vitro вызывает появление в клетках хромосомных аббераций. По­следние сказываются на биологических особенностях культивируемых тканей, изменяя их внешний вид, обмен веществ, скорость роста.