2. Биотехнология рекомбинантных днк к наи­более важным методам биотехнологии рекомбинантных днк сле­дует отнести следующие:

1. Специфическое расщепление ДНК рестрикцирующими нук- леазами, что в значительной степени ускоряет выделение различ­ ных генов и манипуляции с ними.

2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в очищенном фраг­ менте ДНК, позволяющее определить точные границы гена и ко­ дируемую им аминокислотную последовательность полипептида.

3. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая с большой точностью выявить специфические нуклеотидные последователь­ ности на основе их способности связывать комплементарные ос­ нования.

4. Клонирование ДНК, суть которого сводится к введению ДНК- фрагмента в (плазми- ду или вирус), который используют для трансформации бактерий. Бактериальная клетка после трансформации способна воспроиз­ водить этот фрагмент во многих миллионах идентичных копий.

5. Генетическая инженерия, позволяющая получать модифици­ рованные версии генов и затем внедрять их в клетки или организ­ мы.

Этапы получения рекомбинантной днк

1. Расщепление ДНК в специфических участках нуклеотидных пос­ледовательностей осуществляется особыми ферментами — рест-рикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужерод­ную ДНК. Все ферменты условно можно разделить на следующие группы:

1. используемые для получения фрагментов ДНК;

2. синтезирующие фрагменты ДНК на матрице РНК;

3. соединяющие фрагменты ДНК;

1. позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК;

5) применяемые для приготовления гибридизационных проб. Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК,

опознает в ней специфическую последовательность из 4—6 ну-клеотидов.

Согласно номенклатуре, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает ро­довое название, две последующие — первые буквы вида. Например, фер­мент из Е. сой обозначают как Есо.

Подавляющее большинство ферментов разрывает только двунитевую ДНК с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными (или рестриктами,) с тупы­ми либо липкими концами (рис. 1).

Тупые концы

Липкие концы

Многие рестриктазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов и образованием на концах фрагментов коротких одноцепочечных участков. Они способны образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента (лип­кие концы). Липкие концы позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК в одно целое. Полученный фрагмент ДНК (любо­го происхождения) можно встроить в очищенную ДНК плазмиды или бактериального вируса.

2. Секвенирование днк

Для успешного решения задач генетической инженерии очень важно быстро секвенировать (определить последовательность нук­леотидов) любые очищенные фрагменты ДНК.

В биотехнологии рекомбинантных ДНК обычно используют два различных метода секвенирования ДНК: химический и фермен­тативный. Оба метода чрезвычайно надежны, быстры в исполне­нии и результативны.

1- химический метод секвенирования ДНК Исходный фраг­мент ДНК, меченный ³²Р по 5'-концу, подвергается специфи­ческому расщеплению по определенному нуклеотиду (например, А), в результате чего образуются радиоактивные фрагменты раз­ной длины, которые разделяются по размерам при гель-электро­форезе, а радиоактивные из них выявляются с помощью радиоавто­графии.

2 - Энзиматический метод секвенирования основан на энзиматическом введении нуклеотида, терминирующего полинуклеотидную цепь (рис. 2). В этом случае обычно используют дидезоксирибо-нуклеозидтрифосфаты, в которых дезоксирибоза-3'-ОН, представ­ленная в нормальных нуклеотидах, отсутствует. Такой модифици­рованный нуклеотид, внедряясь в цепь ДНК с помощью ДНК-полимеразы, блокирует присоединение следующего нуклеотида.

Рис.2