2. Генная инженерия растений.

Генно-инженерные методы, в частности технология рекомбинантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следова­тельно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классичес­кие методы селекции. Кроме того, появляется возможность целе­направленного изменения генотипа — трансформации — благо­даря введению определенных генов.

Проблемы выращивания сельскохозяйственных растений свя­заны с перспективой ввода в них генов устойчивости к стрессо­вым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам, генов скороспелости, а также с расширением круга культурных расте­ний, способных к симбиотической фиксации азота и т.д.

Генетическая трансформация заключается главным образом в переносе чужеродных или модифицированных генов в эукариотические клетки.

Получение растений с новыми свойствами из трансформиро­ванных клеток (регенерация) возможно благодаря их свойству тотипотентности, т. е. способности развиваться в целое растение.

Однако возможности генной инженерии растений ограничи­ваются рядом причин. Во-первых, геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих. Это значит, что определение и выде­ление искомых генов — задача очень трудная. Во-вторых, не для всех растений удается подобрать условия регенерации. Стабильно получают растения-регенеранты из протопластов картофеля, лю­церны, томатов, моркови, табака, капусты и др. Регенерацию зла­ков из их клеток пока не всегда удается воспроизвести. Наконец, одна из главных лимитирующих причин — размер гетерологичной ДНК (не более 35 кб для агробактериальной и немного больше для баллистической трансформации), которую можно было бы эффективно вводить в геном растения.

2.1. Получение трансгенных растений

Перенос генов в растительные клетки, так же как в клетки живот­ных, и их встраивание в геном растений (трансформация) осуще­ствляются главным образом благодаря специфическим структу­рам — векторам.

Векторы на основе Ti-плазмид. Некоторые виды агробактерий (Agrobacteria) могут заражать двудольные растения, вызывая об­разование опухолей — корончатых галлов.

Одним из самых силь­ных индукторов опухолей служит почвенная бактерия A. tumefaciens. Способность этой бактерии к образованию опухоли связана с боль­шой внехромосомной плазмидой, получившей название Ti-плазмида (от англ. tumor inducing— индуцирующие опухоль). Ti-плазмиды — это естественные векторы для генов, обладающие всеми функциями, необходимыми для переноса, стабильного включе­ния и экспрессии генетической информации в растениях.

Участок Ti-плазмиды, встречающийся в хромосомах раститель­ных клеток, называется Т-областью в бактерии и Т-ДНК в клет­ках растений. Т-область включает примерно 10% Ti-плазмиды и содержит гены, отвечающие за индукцию опухоли, Важно отметить, что все гены, ответственные за перенос и интеграцию генов Т-области, находятся не в ней самой, а ря­дом — в области вирулентности — vir-области (рис. 5.17).

Т-область

Недостаток этих плазмид состоит в том, что некоторые гены, находящиеся в Т-ДНК, заставляют расти клетки растений незави­симо от гормонов, вносимых в питательную среду, на которой куль­тивируются данные клетки. В свя­зи с этим очень трудно регене­рировать нормальное растение из клеток, содержащих полную последовательность Т-ДНК.

Дру­гой недостаток — большие раз­меры Ti-плазмиды, из-за кото­рых затруднены какие-либо ма­нипуляции с ней, поэтому вста­вить ген в плазмиду традицион­ными методами невозможно.

Ri- плазмиды. Существуют и другие бактерии (A. rhizogenes), вызывающие уси­ленное образование корешков при заражении растений. За этот процесс ответственны содержащиеся в них так называемые Ri-плазмиды (от англ. root inducing — индуцирующий корни). Ri-плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они служат ес­тественными безвредными векторами, так как трансформирован­ные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В связи с этим Ri-плазмиды в данный момент рассматриваются как более перс­пективные векторы.

Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений.

Виру­сы можно рассматривать как разновидности чужеродной нуклеи­новой кислоты, которые реплицируются и экспрессируются в клет­ках растений. Подавляющее большинство фитовирусов в качестве носителя генетической информации содержат РНК. Только 1 — 2 % вирусов, инфицирующих растения, относятся к ДНК-содержащим. Именно эти вирусы удобны для использования в технологии рекомбинантных ДНК, а также в качестве векторов.

Вирусные векторные системы имеют еще ряд преиму­ществ:

1-малый размер генома (возможность легкой манипуляции вирусной ДНК)

2- сильные промоторы, обеспечивающие эффек­тивную экспрессию чужеродных генов.

Однако вирусы в качестве векторов обладают и недостатками:

1- имеют небольшую емкость, патогенны и неспособ­ны встраиваться в хромосомы хозяина. Следовательно, часть вирусного генома, ответственная за упа­ковку в вирусные частицы, может быть удалена и замещена до­полнительной чужеродной ДНК.

2- Другой недостаток — отсутствие способности встраиваться в геном растительной клетки — удается обойти (по крайней мере для ВМЦК) благодаря специальному методическому приему — агроинфекции.

Методы прямого переноса генов в растение. Эти методы возник­ли благодаря появлению специфического объекта — изолирован­ных протопластов, т. е. клеток, лишенных целлюлозной стенки.

Методы прямого переноса генов довольно многочисленны:

1. Трансформация растительных протопластов. Осуществляется благодаря комбинации методик кальциевой преципитации ДНК (CaCl2 + ПЭГ) и слияния протопластов. Для трансформации может быть исполь­ зован практически любой ДНК-вектор. Культуру протопластов на начальной стадии ее роста заража­ ют агробактериями, которые используют в качестве векторов.

2. Микроинъекции ДНК. Аналогичен методу микроинъекций животных клеток. Этот метод можно рассматривать как наиболее универсальный. Эффективность трансформации растительных кле-

ток — 10 —20 % независимо от типа вектора. Трансформация

не видоспецифична, возможен перенос генов в любое растение.

4. Электропорация. Метод основан на повышении проницаемо­ сти биомембран за счет действия импульсов высокого напряже­ ния. В результате молекулы ДНК проникают в клетки через поры в клеточной мембране.

5. Упаковка в липосомы. Это один из методов, позволяющих защитить экзогенный генетический материал от разрушения нук- леазами растительной клетки. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами.