2. Устройство и принципы работы узлов масс спектрометра

Узел ввода пробы

Ввод образца был одной из первых проблем в масс-спектрометрии. Для проведения анализа масс образца, который первоначально находится при атмосферном давлении (760 мм рт. ст. – 760 Торр), он должен быть введён в прибор таким образом, чтобы вакуум внутри последнего остался практически неизменным (~10^–6 Торр).

Основными методами ввода образца являются прямое введение зонда или подложки, прямое вливание или впрыскивание в устройство ионизации.

Прямое введение

Использование прямого введения зонда/подложки – очень простой способ доставки образца в прибор. Образец сначала размещается на зонде, а затем вводится в ионизационную зону масс-спектрометра, обычно через вакуумный клапан. Далее образец подвергается процессу десорбции (лазерная десорбция) или прямому нагреванию, чтобы обеспечить испарение и ионизацию.

Прямое вливание или впрыскивание

Для помещения образца в газообразной форме или в растворе используется простой капилляр или капиллярная колонка. Прямое вливание также удобно, т.к. оно позволяет эффективно вводить малые количества вещества в масс-спектрометр без нарушения вакуума.

Капиллярные колонки обычно используются для разграничения систем разделения и устройства ионизации. Эти системы, включая газовую хроматографию (ГХ) и жидкостную хроматографию (ЖХ), также служат для разделения различных компонентов раствора, важных для анализа масс. Как только пары образца покидают хроматограф, они направляются в масс-спектрометр.

Узел ионизации

Вторым этапом в масс-спектрометрии является процесс ионизации –образование ионов из нейтральных молекул и атомов, составляющих вещество. Этот процесс по-разному осуществляется для органических и неорганических веществ.

Механизмы ионизации

Протонирование – механизм ионизации, при котором к молекуле присоединяется протон, сообщая ей заряд 1+. Положительные заряды обычно локализуются на основных частях молекулы, таких, как амины, с образованием стабильных катионов. Пептиды часто ионизируются при помощи протонирования.

Депротонирование – механизм ионизации, при котором заряд 1– получается при отрыве протона от молекулы. Используется при определении кислотных образцов – фенолов, карбоновых кислот и др.

Катионизация – заряженный комплекс образуется при координационном присоединении положительно заряженного иона; к нейтральной молекуле. Катионизацией считается присоединение иона, отличного от протона, например щелочного металла или аммония (Na⁺, K⁺, NH₄⁺). Процесс применяется к молекулам, неспособным к протонированию. Заряд остаётся локализован на катионе. Катионизации с Na⁺ подвергаются, например, углеводы.

Прямой перенос заряженной молекулы в газовую фазу

Перенос соединений, уже заряженных в растворе, легко достигается при использовании десорбции или выбрасыванием заряженных частиц из конденсированной фазы в газовую.

Отрыв электрона

Отрыв электрона придаёт молекуле заряд 1+ при выбивании электрона, так что при этом часто образуются катион-радикалы. Отрыв электрона применяется для относительно неполярных соединений с низкой молекулярной массой. Он часто приводит к образованию значительных количеств фрагментарных ионов.

Захват электрона

При захвате электрона, молекуле сообщается заряд 1–. Этот механизм ионизации используется для молекул с большим сродством к электрону, например, галогенсодержащих соединений.

Таблица 1. Механизмы ионизации, их преимущества и недостатки

Механизм ионизации	Преимущества	Недостатки
Протонирование (положительные ионы)	многие соединения присоединяют протон с получением заряда; многие способы ионизации − ESI, APCI, FAB, CI и MALDI производят такие частицы	многие соединения не стабильны в протонированной форме (например, углеводы) или с трудом присоединяют протон (например, углеводороды)
Катионизация (положительные ионы)	многие соединения присоединяют катион, многие способы ионизации − ESI, APCI, FAB и MALDI производят такие частицы	опыты тандемной масс-спектрометрии на катионизированных молекулах часто дают очень ограниченную информацию при фрагментации
Депротонирование (отрицательные ионы)	многие вещества являются кислотами; многие способы ионизации, − ESI, APCI, FAB и MALDI производят такие частицы	Применим только для специфических соединений
Перенос заряженных молекул в газовую фазу (положительные и отрицательные ионы)	используется для соединений, которые уже заряжены; многие способы ионизации − ESI, APCI, FAB и MALDI производят такие частицы	Применим только для уже заряженных частиц
Отрыв электрона (положительные ионы	наблюдается при электронной ионизации и даёт информацию не только о молекулярной массе, но и информацию о фрагментарных ионах	часто производит слишком сильную фрагментацию, что ведет к неправильному толкованию результатов
Захват электрона (отрицательные ионы)	наблюдается при электронной ионизации и даёт информацию не только о молекулярной массе, но и информацию о фрагментарных ионах	часто производит слишком сильную фрагментацию, что ведет к неправильному толкованию результатов

Способы ионизации

Способы ионизации органических соединений

Вплоть до 1980-х электронная ионизация (EI) была основным способом ионизации для анализа масс. Однако EI ограничивается малыми молекулами, масса которых намного ниже массы большинства биоорганических соединений.

Это ограничение побудило разработать другие способы ионизации –бомбардировку быстрыми атомами/ионами (FAB), лазерную ионизацию из матрицы (MALDI) и ионизацию электроспрея. Эти способы совершили революцию в биомолекулярном анализе, особенно для больших молекул.

Таблица 2. Способы ионизации

Способ ионизации	Аббревиатура	События
Ионизация электроспрея	ESI	испарение заряженных капель
Ионизация наноэлектроспрея	nanoESI	–
Химическая ионизация при атмосферном давлении	APCI	коронный разряд и перенос протона
Лазерная десорбция/ионизация из матрицы	MALDI	поглощение фотона/перенос протона
Десорбция/ионизация на кремнии	DIOS	десорбция иона/перенос протона
Бомбардировка быстрыми атомами/ионами	FAB	пучок ионов
Электронная ионизация	EI	пучок электронов/перенос электрона
Химическая ионизация	CI	перенос протона

MALDI и ESI сейчас являются самыми распространёнными способами ионизаций для биомолекулярной масс-спектрометрии, с их превосходными диапазонами масс и чувствительностью (рис. 1).

Ионизация электроспрея (ESI)

Суть ESI заключается в следующем. Ионизация частиц происходит при создании тонкого спрея сильно заряженных капель. Раствор распыляется из области с сильным электрическим полем (700 …5000 В) на конце металлической форсунки (игла, капилляр).

Этот метод обычно применяется для пептидов, белков, углеводов, синтетических полимеров и липидов.

П ри ионизацияи электроспрея образуются единично заряженные малые молекулы или многократно заряженные большие молекулы, т.е. Многократная зарядка делает возможным наблюдать очень большие молекулы.

Например, белок с массой 10000 дальтон и его масс-спектр с зарядами до +5 показаны на рис. Механизм ионизации белка − протонирование, что не только добавляет заряд, но также увеличивает массу белка на число добавленных протонов. Масса белка и отношение m/z меняется в зависимости от числа зарядов на белке. Подобные закономерности характерны и для других процессов катионизации, например, с Na⁺ и Cs⁺.

Растворители для электроспрея

Растворители в ESI выбираются в зависимости от растворимости исследуемых соединений, летучести растворителя и способности растворителя к отдаче протона. Обычно, основными являются протонные растворители – метанол, 50/50 метанол/вода или 50/50 ацетонитрил/вода. Некоторые апротонные сорастоврители, например, 10% ДМСО в воде, изопропиловый спирт, используются для улучшения растворимости некоторых соединений.

Вода редко используется в ESI, т.к. имеет относительно низкое давление насыщенного пара. Лучшая чувствительность получается при добавлении летучего органического растворителя. Ионы Na⁺, K⁺, фосфаты и др. соли снижают давление пара капель, что ведет к ослаблению сигнала.

Ионизация наноэлектроспрея (nanoESI)

Электроспрей низкого потока, впервые описанный Вильмом и Манном, назвали наноэлектроспреем, наноспреем и микроэлектроспреем. Такой способ ионизации является вариацией ESI, в которой игла спрея сделана очень маленькой и расположена близко к входу в масс-анализатор. Конечным результатом такой простой корректировки становится увеличение эффективности, которое включает уменьшение необходимого количества образца.

Скорости потока для nanoESI обычно составляют от десятков до сотен нанолитров в минуту. Чтобы получить такие малые скорости потока, nanoESI использует источники из вытянутого и, в некоторых случаях, металлизированного стекла или плавленого кварца с малым входным отверстием (~ 5 мкм). Растворённый образец вносится в источник и к его концу прикладывается давление порядка 2 атм. Вытекание образца с очень малой скоростью позволяет достигать высокой чувствительности. Также, источники расположены очень близко к входу в масс-анализатор, поэтому перенос ионов в масс-анализатор намного более эффективен.

Например, анализ 5 mM раствора пептида при помощи nanoESI займёт одну минуту, употребив ~50 фемтомоль образца. Такой же эксперимент с обычным ESI за то же время израсходует 5 пикомоль, т.е. в 100 раз больше, чем nanoESI. К тому же, так как капли для nanoESI обычно меньше, чем для обычного ESI, необходимое для образования ионов испарение намного меньше. Следовательно, nanoESI менее чувствительно к солям и другим примесям, т.к. меньшее испарение означает, что примеси не будут концентрироваться так сильно, как при ESI.

Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI)

APCI – способ ионизации, при котором ионы генерируются непосредственно из раствора. APCI-устройстве имеется горячий испаритель, который обеспечивает быстрое испарение незаряженных капель анализируемого вещества (аналита). Далее молекулы образца в паре проходят через зону ионно-молекулярной реакции при атмосферном давлении.

В APCI ионизация аналита происходит при взаимодействии с ионами растворителя, который в свою очередь, ионизируется коронным разрядом.. При этом способе ионизации образуются только положительные +1 или отрицательные –1 молекулярные ионы и практически не происходит фрагментация (распад молекул). Давление газа уменьшает фрагментацию во время ионизации и ведет к образованию практически только нетронутых молекулярных ионов.

Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI)

Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI) стала сейчас важным способом ионизации, потому что она генерирует ионы непосредственно из раствора с относительно малым фоновым сигналом и способна к анализу относительно неполярных соединений. Так же, как и APCI, поток жидкости для APPI вводится прямо в устройство ионизации.

Основное различие между APCI и APPI состоит в том, что в APPI парообразный образец облучается УФ-светом (обычная криптоновая лампа испускает от 10…10,6 эВ). Часто APPI является намного более чувствительным, чем ESI или APCI и показывает более высокое соотношение сигнал/шум из-за более низкой ионизации фона.

Недостатком ESI и APCI является также то, что они образуют фоновые ионы растворителей. Кроме того, в ESI идут процессы подавления ионов, а APCI требует испарения при температурах 350…500°C, что может вызвать термическое разложение.

Лазерная десорбция/ионизация из матрицы (MALDI)

Масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией в матрице (MALDI-MS) впервые была использована в 1988 году Танакой, Карасом и др. С тех пор метод стал широко использоваться для анализа пептидов, белков и большинства других биомолекул. Эффективный и направленный перенос энергии во время акта индуцированной лазером десорбции приводит к большому выходу ионов незатронутого аналита.

Х отя точный механизм процесса неизвестен, считается, что MALDI вызывает ионизацию и перевод образца из конденсированной фазы в газовую посредством лазерного возбуждения и индивидуализации молекул образца из матрицы.

В MALDI аналит сначала сокристаллизуется с большим молярным избытком матричного соединения, обычно УФ-поглощающей слабой органической кислотой. Облучение такой смеси аналита с матрицей лазером приводит к испарению матрицы, которая несёт аналит в себе. Матрица играет ключевую роль в этом методе. Сокристаллизованные молекулы образца также испаряются, но без прямого поглощения энергии лазера. Органические молекулы, чувствительные к лазерному излучению, защищены от прямого возбуждения УФ-лазером.

Матрица MALDI – нелетучий твёрдый материал, обеспечивающий процессы десорбции и ионизации посредством поглощения лазерного излучения. Как результат, и матрица, и любой образец, встроенный в неё, испаряются. Матрица также служит для того, чтобы минимизировать ущерб образцу от лазерного излучения, поглощая большую часть падающей энергии.

Десорбированные заряженные молекулы в газовой фазе затем электростатически направляются из MALDI-устройства ионизации в масс-анализатор.

Ценность MALDI для анализа биомолекул основана на её способности давать информацию о молекулярной массе неповреждённых молекул. Способность давать точную информацию может быть чрезвычайно важна для определения и характеристики белков. Например, белок часто может быть однозначно определён точным анализом масс составляющих его пептидов (полученных химическим или же ферментативным воздействием на образец).

Таблица 3. Преимущества и недостатки метода лазерной десорбции/ионизации в матрице (MALDI).

Преимущества Недостатки практический диапазон масс до 300000 Da. Экземпляры со значительно большей массой наблюдались при помощи детектора высокого тока; фон матрицы, который может быть проблемой для соединений с массой ниже 700 Da. Помехи этого фона сильно зависят от материала матрицы; обычная чувствительность порядка нескольких фемтомоля и даже до аттомоля; возможно фоторазложение при лазерной десорбции/ионизации; мягкая ионизация с малой фрагментацией; кислотные матрицы, используемые в MALDI могут вызывать разложение некоторых соединений нечувствителен к солям в концентрациях до миллимолярных; удобен для анализа сложных смесей

Приготовление образца и матрицы оказывает значительное влияние на качество масс-спектров MALDI белков и пептидов. Среди большого разнообразия известных методов приготовления наиболее часто употребляемым является метод высушенной капли. В этом случае насыщенный раствор матрицы смешивается с раствором аналита так, чтобы соотношение матрицы к аналиту было около 5000:1. Аликвота (0,5-2,.0 мкл) такой смеси затем помещается на место образца и высушивается.

Также образцы могут быть приготовлены последовательным способом. В тонкослойном методе сначала на цель наносится гомогенная «плёнка» матрицы, а затем туда добавляется образец, который абсорбируется ею. Этот метод даёт хорошую чувствительность, разрешающую способность и точность определения.

В варианте толстослойного метода в качестве подложки к мАтрице используется нитроцеллюлоза (NC) После образования единого слоя NC-матрица к нему добавляется образец. Этот метод приготовления предотвращает образования щелочных аддуктов и значительно увеличивает чувствительность определения, особенно для пептидов и белков, экстрагированных из гелей.

Десорбция/ионизация на кремнии (DIOS)

DIOS – свободный от матрицы метод, который использует импульсную десорбцию/ионизацию на кремнии. Поверхности структурированного пористого кремния или кремниевого нановолокна являются УФ-поглощающими полупроводниками с большой площадью поверхности (сотни м²/см³).

Строение структурированного кремния обеспечивает каркас для накопления молекул растворителя и аналита, а поглощение УФ даёт механизм для передачи энергии лазера аналиту. Такая удачная комбинация свойств позволяет DIOS быть применимым для большого разнообразия биомолекул, включая пептиды, углеводы и небольшие органические соединения различных типов. В отличие от других прямых безматричных методов десорбции DIOS позволяет проводить десорбцию/ионизацию с малым разложением аналита или вообще без него.

Длина волны лазера (337 нм), обычно применяемая в MALDI, подходит и для DIOS. Хотя DIOS сравним с MALDI в отношении чувствительности, у него есть несколько преимуществ из-за отсутствия мешающей матрицы: низкий фон на малых диапазонах массы, размещение водных образцов, упрощённая подготовка образцов.

Бомбардировка быстрыми атомами/ионами (FAB)

Бомбардировка быстрыми атомами/ионами, или FAB – метод ионизации, похожий с MALDI, так как в нём используется матрица и пучок высокоэнергетических частиц для десорбции ионов с поверхности. Отличие состоит в том, что в MALDI, энергетический пучок представляет собой импульсный лазерный свет, а в FAB использует непрерывный пучок ионов. В MALDI матрица обычно твёрдая кристаллическая, а в FAB обычно использует жидкую матрицу. FAB примерно в 1000 раз менее чувствителен, чем MALDI.

Бомбардировка быстрыми атомами – мягкий способ ионизации, в котором используется прямое введение зонда для подачи образца, пучок нейтральных атомов Xe или ионов Cs⁺ для распыления и ионизации частиц образца и матрицы с поверхности зонда.

Обычно в FAB-спектре обнаруживаются ионы протонированные или катионизированные матрицы (M⁺Na⁺) и молекулярные ионы аналита.

Матрица FAB – нелетучая жидкость, которая служит для постоянного восполнения поверхности новым образцом по мере того, как он бомбардируется пучком ионов. Поглощая большую часть падающей энергии, матрица также минимизирует разложение образца из-за высокоэнергетических частиц образца.

Две наиболее часто употребляющихся матрицы для FAB – м-нитробензиловый спирт и глицерин.

Электронная ионизация (EI)

Электронная ионизация – один из наиболее используемых способов ионизации для повседневных анализов малых гидрофобных термически стабильных молекул (М < 400 дальтон). Электронная ионизация не применяется для соединений с большой молекулярной массой, потому что необходимая термическая десорбция образца ведёт к температурному разложению до того, как происходит испарение.

EI обычно даёт большое число фрагментарных ионов и считается «жёстким» способом ионизации. Однако, фрагментарная информация также может быть очень полезной. Например, используя базы данных, содержащие свыше 200000 масс-спектров электронной ионизации, возможно определить неизвестное соединение в течение нескольких секунд, если оно есть в базе данных. Эти базы (например, база NIST) позволяют быстро идентифицировать малые молекулы.

В устройстве электронной ионизации образец должен поставляться в газообразной форме, что осуществляется «выкипанием» образца посредством термической десорбции или введением газа через капилляр. Капилляр часто является выходом капиллярной колонки прибора газовой хроматографии. В этом случае капиллярная колонка обеспечивает разделение (это также известно как газовая хромат-масс-спектрометрия – GC/MS). Десорбция твердых или жидких образцов производится нагреванием в вакууме масс-спектрометра. После перехода в газовую фазу соединения переносятся в устройство электронной ионизации, где электроны возбуждают молекулу, тем самым вызывая ионизацию отрывом электрона и фрагментацию.

Принципиальными проблемами, связанными с термической десорбцией при электронной ионизации являются 1) нелетучесть больших молекул, 2) термическое разложение, 3) избыточная фрагментация.

Механизм отрыва электрона при образовании положительного иона осуществляется следующим образом:

Образец термически испаряется.

Электроны испускаются нагретым катодом и ускоряются электрическим полем.

Молекулы образца проходят через пучок электронов.

Электроны с кинетической энергией 70 эВ передают часть своей энергии молекулам. Эта передача вызывают ионизацию (отрыв электрона) так, что ион сохраняет обычно не более 6 эВ избыточной энергии.

Избыток внутренней энергии (6 эВ) в молекуле ведёт к некоторой фрагментации.

Химическая ионизация (CI)

Химическая ионизация (CI) применяется к образцам, сходным с анализируемыми при помощи EI, и обычно применяется, чтобы увеличить долю молекулярного иона. Химическая ионизация использует газофазные ионно-молекулярные реакции в вакууме масс-спектрометра для получения ионов из молекул образца. Процесс химической ионизации инициируется газом-реагентом, таким, как метан, изобутан или аммиак, который ионизируется электронным ударом. Высокое давление газа в устройстве ионизации приводит к ионно-молекулярным реакциям между ионами газа-реагента и его нейтральными молекулами. Некоторые продукты ионно-молекулярных реакций могут реагировать с аналитом с образованием ионов.

Возможные механизмы ионизации при CI:

Реагент (R) + e- → R⁺ + 2 e-

R⁺ + RH → RH⁺ + R

RH⁺ + Аналит (A) → AH⁺ + R

В отличие от EI, аналит с большей вероятностью образует молекулярный ион с меньшей фрагментацией при использовании CI. Однако, аналогично EI, образцы должны быть термически стабильными, так как испарение в CI-устройстве осуществляется при помощи нагревания.

Ионизация неорганических веществ

Для ионизации неорганических материалов (металлы, сплавы, горные породы и т.д.), в которых энергии связи атомов в твердых телах гораздо больше, применяют значительно более жесткие методы ионизации.

Первый метод, наиболее распространенный, – это ионизация в индуктивно-связанной плазме. Индуктивно-связанная плазма (ИСП, ICP) образуется внутри аргоновой горелки. Аргон – инертный негорючий газ, поэтому для его сгорания применяют индукционную катушку. При попадании в плазму аргоновой горелки атомы и молекулы превращаются в ионы. Для введения вещества в горелку, его предварительно растворяют в воде и распыляют в плазму в виде мельчайшей взвеси.

В методе лазерной абляции вещество переводят в газ с помощью мощного лазерного луча, который "взрывает" кратер в подставленном под него кусочке материала, переводя небольшую его часть в газообразное состояние.

В методе термоионизации анализируемое вещество наносится на проволочку из тугоплавкого металла, по которой пропускается ток, разогревающий ее до высокой температуры. За счет высокой температуры нанесенное вещество испаряется и ионизируется. Этот метод обычно используется в изотопной масс-спектрометрии.

Для токопроводящих материалов применяется искровая ионизация и ионизация в тлеющем разряде. В первом случае за счет разницы потенциалов между навеской исследуемого материала и другим электродом пробивается искра, вырывающая с поверхности мишени ионы. Во втором – ионы образуются за счет тлеющего разряда, поджигаемого между кусочком проводящего материала и электродом в атмосфере инертного газа, находящегося под очень низким давлением (того же аргона в большинстве случаев).

Масс-анализаторы

После получения ионов их вытягивают из ионизатора с помощью электрического поля. Третьим этапом масс-спектрометрического анализа является сортировка ионов по массам (точнее по отношению ). Это происходит в масс-анализаторе. Существует несколько типов масс-анализаторов.

Магнитный масс-анализатор

Все масс-анализаторы используют физические законы движения заряженных частиц. Исторически первым масс-анализатором, остающимся непревзойденным по своим характеристикам и сегодня, был магнит. Согласно физическим законам, траектория заряженных частиц в магнитном поле искривляется, а радиус кривизны зависит от массы частиц. Именно это используется для анализа ионов по массам. Для того, чтобы увеличить разрешение, на пути ионов устанавливается еще и электростатический анализатор. Магнитные масс-спектрометры имеют высокое разрешение и могут использоваться со всеми видами ионизации.

Несмотря на значительные преимущества современных магнитных масс-анализаторов перед остальными (рекордная чувствительность, однозначность идентификации, большой рабочий диапазон масс, широкий линейный диапазон), они обладают двумя основными недостатками – эти приборы имеют большие размеры, используют высокие напряжения (тысячи вольт) и достаточно дороги. Они используются в органическом анализе с высоким разрешением, анализе изотопов, элементном анализе на предельной чувствительности.

Квадрупольный масс-анализатор

Кроме магнита в масс-анализаторе используется квадрупольный анализатор. (Р. Финниган, 1967). Квадруполь представляет собой четыре стержня, к которым попарно в противоположной полярности подается определенная комбинация постоянного и радиочастотного переменного напряжений. Ионы, влетающие параллельно оси этих стержней, попадают в гиперболическое поле и оно, в зависимости от соотношения их массы (как всегда, m/z) и частоты, пропускаются этим полем или не пропускаются дальше.

Создание квадрупольных масс-анализаторов стало революцией в масс- спектрометрии. Эти анализаторы имеют упрощенную (по сравнению с магнитами) конструкцию, упрощенную систему создания вакуума, небольшие размеры, и, что самое главное, намного дешевле, что открыло возможность использовать этот аналитический метод многим тысячам пользователей.

Ионные ловушки

Дальнейшее развитие квадрупольных анализаторов привело к созданию "ионной ловушки". В ней одна пара стержней была закручена в кольцо, а вторая пара превратилась в шарообразные чашки. Теперь комбинация радиочастотных и постоянных напряжений, прикладываемых к электродам ионной ловушки, стала позволять удерживать ионы внутри нее или выбрасывать их. Первые ионные ловушки были выпущены фирмой Finnigan в 1983 году.

Существенным моментом работы ионных ловушек является подбор времени, в течение которого ионы остаются в ловушке. С одной стороны, это время должно быть достаточно "большим" (речь идет о милисекундах) для того, чтобы можно было провести фрагментацию ионов, выбросить из ловушки ненужные, провести эту и другие манипуляции с ионами несколько раз. С другой стороны, слишком длительное время в ловушке приводит к нежелательным ионным реакциям, которые искажают масс-спектр.

Для того, чтобы избежать побочных процессов используют патентованную систему AGC (Automatic Gain Control), которая "следит" за количеством ионов в ловушке. Система делает очень короткий прескан, при котором определяется концентрация ионов, затем подстраивается время, в течение которого ионы остаются в ловушке и делается аналитическое сканирование.

Появление квадрупольных ловушек на базе линейных квадруполей также явилось существенным прорывом в технологии МС-анализа. Линейная квадрупольная ловушка характеризуется большей емкостью ионов, в ней можно проводить контролируемую фрагментацию или отбор ионов за меньшее время.

В настоящее время многие фирмы выпускают МС с квадрупольной ловушкой. Например, фирма Thermo Fisher Scientific выпускает два типа таких приборов – LTQ XL и LXQ. Прибор LTQ XL является самым чувствительным масс-спектрометром в мире. Масс-спектрометры на базе ионной ловушки с внутренним источником ионов в настоящее время выпускаются фирмой Varian.

Использование ионных ловушек дало импульс к развитию систем тандемной масс-спектрометрии или МС/МС. В системе МС/МС масс-анализаторы выстраивают последовательно друг за другом. В этом случае сложные органические молекулы разбивают фрагменты. Из разделенных в первом масс-анализаторе ионов выбирают те, которые представляют интерес. Во втором масс-анализаторе их разбивают на более мелкие фрагменты и снова рассортировывают по массам и т.д.

В ионной ловушке можно удерживать ионы, которые представляют интерес, а остальные "выбросить" из нее. Оставшиеся в ловушке ионы можно подвергнуть распаду (управляемой фрагментации), зарегистрировать их и так до 10…15 раз.

Тандемную масс-спектрометрию в сочетании с ГХ (ГХ/МС) используют в целевом анализе, если концентрация определяемых веществ намного меньше, чем концентрация матрицы (основных компонентов). Например, пестициды, загрязнители пищевой продукции и окружающей среды, диоксины. Сигналы этих веществ не видны за "химическим шумом" или сигналом матрицы. Если регистрировать один родительский и один (или несколько) дочерних ионов, то при их появлении можно однозначно говорить о детектировании целевого компонента, достигая очень высокой чувствительности.

На сегодняшний день в этой области самым передовым и распространенным методом анализа стал 2DLC-ESI-MS/MS, то есть двумерная микроколоночная высокоэффективная жидкостная хроматография – ионизация в электроспрее – тандемная масс-спектрометрия, а самым распространенным прибором – LCQ.

Ионно-циклотронный резонанс

Для определения сложных органических веществ – протеинов, метаболитов, липидов (протеомики, метаболомики, липидомики) и анализа биополимеров, широкое распространение получил масс-анализатор на основе ионно-циклотронного резонанса. Именно этот тип масс-анализатора позволяет наиболее точно измерять массу иона и обладает очень высоким разрешением. Высокое разрешение позволяет работать с полипротонированными ионами, образующимися при ионизации белков и пептидов в электроспрее, а высокая точность определения массы позволяет получать брутто-формулу ионов, определять структуру последовательностей аминокислотных остатков в пептидах и белках, а также детектировать послетрансляционные модификации белков. Это сделало возможным секвенировать белки без их предварительного гидролиза на пептиды. Такой способ получил название "Top-down" протеомики.

Получение уникальной информации стало возможно благодаря применению масс-анализатора ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием. В этом анализаторе ионы влетают в сильное магнитное поле и вращаются там по циклическим орбитам (как в циклотроне, ускорителе элементарных частиц). Для своей работы он требует сильного магнитного поля со сверхпроводящим соленоидом, поддерживаемым при очень низкой температуре (жидкого гелия, приблизительно –270 ^оС). Примером такого масс-спектрометра является LTQ FT.

Имеется видео информация, позволяющая представить процессы захвата, фрагментации и анализа ионов в линейной квадрупольной ионной ловушке.

Время-пролетный анализатор

При исследовании соединений, непереводимых в газовую фазу, также популярны "время-пролетные" (Time Of Flight, TOF) масс-анализаторы. В них ионы движутся в бесполевом пространстве. Ионы из источника разгоняются электрическим полем, приобретая достаточно большую кинетическую энергию, и вылетают в бесполевое пространство. На входе в это пространство все ионы имеют одинаковую кинетическую энергию. В зависимости от массы (E = mv²/2) ионы будут двигаться с разными скоростями и, соотвественно, в разное время достигнут детектора, расположенного в конце трубы их пролета. Зарегистрировав их и измерив время, рассчитывают их массу. Все процессы происходят за миллионные доли секунды.

На основе такого масс-анализатора был создан очень быстрый масс-спектрометр, который используется при анализе смеси огромного количества индивидуальных соединений (например, нефть). Примером такого прибора является GC/TOF MS TEMPUS.

На таких анализаторах гораздо проще получать очень широкий диапазон масс, то есть можно измерять массы очень больших молекул. На базе квадрупольных анализаторов это сделать невозможно, недостаточно энергии для разгона больших молекул. Магнитные анализаторы такого масштаба окажутся слишком большими (рабочий диапазон масс магнитного анализатора пропорционален магнитному полю). Время-пролетные анализаторы применяются для измерений масс огромных молекул (с массами в десятки и сотни тысяч атомных единиц). А наиболее подходящим методом ионизации оказался описанный выше MALDI (ионизация лазерной десорбцией с матрицы).

Орбитальная ловушка ионов

В июне 2005 года представлен серийный масс-спектрометр, использующий новый масс-анализатор – орбитальную ловушку ионов, которая была изобретена российским физиком Александром Макаровым, работающим в Thermo Fisher Scientific в Бремене (Германия).

Эта ловушка не использует ни магнитных полей, как масс-спектрометр с двойной фокусировкой или ионно-циклотронного резонанса, ни радиочастот, как квадруполи или квадрупольные ионные ловушки. Этот масс-анализатор, базируется на электростатической аксиально-гармонической орбитальной ловушке ионов, которая использует симметричное статическое электрическое поле между внешним и внутренним электродами специальной формы. Попадающие в поле ионы начинают двигаться по стабильным циклическим траекториям вокруг центрального электрода и одновременно осцилировать вдоль оси центрального электрода.

Благодаря тому, что аксиальная осциляция не зависит от энергии ионов и тому, что электрическое поле установливается с высокой точностью и стабильностью, может быть достигнуто высокое разрешение и масса может быть измерена с высокой точностью. Орбитальная ловушка также характеризуется большей емкостью ионов

Детекторы

Последним элементом масс-спектрометра является детектор заряженных частиц. Первые масс-спектрографы использовали в качестве детектора фотопластинку. Сейчас используются динодные вторично-электронные умножители, в которых ион, попадая на первый динод, выбивает из него пучок электронов, которые в свою очередь, попадая на следующий динод, выбивают из него еще большее количество электронов и т.д.

Другой вариант – фотоумножители, регистрирующие свечение, возникающее при бомбардировке ионами люминофора. Кроме того, используются микроканальные умножители, системы типа диодных матриц и коллекторы, собирающие все ионы, попавшие в данную точку пространства (коллекторы Фарадея).