Собственные исследования

В хозяйстве СПК «Боевик» абортировала корова в возрасте 3 лет. Ветеринарный врач, проведя внешний осмотр и выяснив с какой клинической картиной протекала болезнь поставил предварительный диагноз – бруцеллез. При этом для исследования в лабораторию с сопроводительным документом (приложение, табл.2) отправляем следующий патологический материал: абортированный плод с плодовыми оболочками – для бактериологического исследования и кровь от коровы – для серологического исследования. Плодные оболочки содержат эритриол – фактор роста для бруцелл, и бактерии в большом количестве заселяют их. Кровь берем для непосредственного обследования коровы. При обострении процесса бруцеллы из клеток лимфоидно-макрофагальной системы проникают в кровь, вызывая различной интенсивности бактериемию и рецидив, а также при гибели бруцелл эндотоксин проникает в ток крови. Лабораторные исследования проводим согласно схеме бактериологического исследования патологического материала на бруцеллез (приложение, таб.1)

В первый день исследований делаем 2 мазка из патологического материала – плодных оболочек, для этого:

1. Над пламенем обезжириваем стекло

2. В правую руку берем ножницы, в левую – пинцет. Прокаливаем над пламенем спиртовки.

3. Придерживая пинцетом патологический материал, отрезаем небольшой кусочек. Проводим несколько раз по стеклу.

4. Еще раз прокаливаем ножницы и пинцет для дезинфекции, ставим на место.

5. Когда мазок подсохнет, фиксируем его над пламенем спиртовки.

Первый мазок окрашиваем по Граму:

1. На фиксированный мазок помещаем полоску фильтровальной бумаги, пропитанную спиртовым раствором генциан кристалвиолета, наносим на нее несколько капель дистиллированной воды для увлажнения, выдерживаем 2 мин, бумажку удаляем.

2. Препарат, не промывая, обрабатываем раствором Люголя 2 мин, раствор сливаем.

3. Наносим 96% этанол на 45 с.

4. Препарат тщательно промываем водой

5. Окрашиваем фуксином Пфейффера 2 мин.

6. Вновь промываем водой, подсушиваем фильтровальной бумагой и микроскопируем.

Микроскопическая картина: кокковидные или палочковидные бактерии красного цвета – грамотрицательные.

Второй мазок окрашиваем по Козловскому:

1. Фиксированный на пламени мазок окрашиваем 2%-ным раствором сафранина.

2. Подогреваем до появления пузырьков, промываем водой

3. Докрашиваем 1 мин 1%-ным раствором малахитовой зелени, микроскопируем.

Микроскопическая картина: бруцеллы – ярко-красного, другие микроорганизмы – зеленого (или синего) цвета. Морфология увиденных микроорганизмов совпадает с исследованиями, которые провели ряд ученых при изучении бруцеллеза.

Для выделения чистой культуры готовим мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) и печеночно-глюкозно-глицериновый агар (ПГГА).

Способ приготовления МППБ:

1. К 610 см³ мясной воды добавляем 305 см³ печеночного настоя, 10г пептона, 5 г натрия хлорида.

2. Кипятим 60 мин, водой доводим объем до первоначального.

3. Фильтруем, разливаем в пробирки, стерилизуем при 110 ºС 30 мин.

Способ приготовления ПГГА:

1. К 900 см³ печеночного настоя добавляем 9 г пептона, 5 г натрия хлорида, 25 г агар-агара.

2. Варим в автоклаве 60 мин при 110 ºС.

3. Фильтруем, устанавливаем рН 7.

4. Добавляем 20 г глюкозы и 25 см³ глицерина.

5. Разливаем в пробирки, стерилизуем при 110 ºС 30 мин.

Делаем посев микроорганизмов на МППБ:

1. Пробирку с патологическим материалом и пробирку с питательной средой держим в левой руке, в правую руку берем бактериологическую иглу и пробки от пробирок. Все манипуляции проводим над пламенем спиртовки.

2. Обжигаем края пробирок, бактериологическую петлю и вводим ее в пробирку с материалом, переносим материал в пробирку со стерильной питательной средой, стряхиваем с петли в среду, не смачивая при этом петледержатель.

3. Края пробирок вновь проводим над пламенем горелки, закрываем пробирки пробками, стерилизуем петлю и ставим ее в штатив.

Делаем посев на ПГГА:

1. Пробирки с засеваемой культурой и питательной средой берем в левую руку, пробирку с ПГГА держим скошенной поверхностью среды вверх

2. В открытую у пламени пробирку с патологическим материалом вводим простерилизованную бактериологическую петлю, слегка прикасаясь петлей к поверхности материала и переносим его в пробирку со стерильной питательной средой.

3. Петлю опускаем до дна пробирки, погружаем в конденсированную жидкость и зигзагообразным движением проводим снизу вверх по поверхности среды (посев «штрихом»).

4. Пробирки закрываем пробками, петлю прожигаем.

Некоторые виды бруцелл растут при повышенном содержании в атмосфере оксида углерода (B. аbortus, B. оvis). Так как неизвестно, каким видом бруцелл заражен исследуемый материал, мы делаем посевы на МППБ и ПГГА в 2 экземплярах и половину посевов инкубируем в обычной атмосфере, другую – в атмосфере, содержащей 15% оксида углерода. Пробирки с посевами ставим в термостат при температуре 37ºС на 30 дней, периодически просматривая. На 30-е сут, исследуем чистые культуры. Рост наблюдаем на средах, инкубируемых как в обычных условиях, так и в атмосфере с 15% СО2. В МППБ видим равномерное помутнение, сформировалось пристеночное кольцо, небольшой осадок, который по мере старения культуры становится вязким и при встряхивании поднимается в виде косички. На ПГГА наблюдаем мелкие, выпуклые, гладкие блестящие, полупрозрачные с голубовато-серым оттенком колонии. Культуральные свойства схожи с описанными свойствами других авторов.

Затем делаем мазки из чистой культуры, окрашиваем по Граму, по Козловскому и микроскопируем: по Граму – кокковидные бактерии окрашиваются в красный цвет – грамотрицательные; по Козловскому – бруцеллы – красные, другие микроорганизмы – зеленые. Морфология увиденных микроорганизмов совпадает с описанием ряда авторов.

Следующим этапом наших исследований будет постановка биопробы – этот метод применяем для выделения из исследуемого материала возбудителя бруцеллеза, испытания патогенности бруцелл.

Для заражения используем морских свинок, т.к. они наиболее восприимчивы к искусственному заражению из подопытных животных и легко обследуются по РА.

Для заражения берем 2 здоровых морских свинок, не бывших под другими опытами и совершенно не реагирующих на бруцеллез. Для этого проводим РА. В начале приготавливаем сыворотку для исследования:

1. Берем кровь из вены у морской свинки при температуре не ниже 18ºС.

2. Оставляем ее при комнатной температуре на 2 – 3 часа. Спустя это время на поверхности образуется сгусток.

3. Делаем обводку: чистой спицей отделяем сгусток.

4. Ставим в холодильник на 6 – 7 часов. Сливаем.

5. Из присланной крови готовим сыворотку.

Делаем постановку РА:

1. Реакцию ставим в объеме 1 мл в чистых пробирках с ровным выпуклым дном в четырех разведениях: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80.

2. Используем антиген (взвесь культуры убитых бруцелл в физиологическом растворе), приготовляемый на биофабриках. Перед употреблением антиген тщательно встряхиваем

3. Для разведения испытуемой сыворотки расставляем в штативе 5 пробирок. В первой пробирке готовим основное разведение. Сыворотку берем в дозе 0,1 мл и добавляем к ней 0,9 мл физиологического раствора (разведение 1:10). Затем в третью, четвертую и пятую пробирки вливаем по 0,5 мл 5%-ного раствора поваренной соли. После этого из первой пробирки с основным разведением сыворотки во вторую и третью пробирки переносим по 0,5 мл разведенной сыворотки. В третьей пробирке сыворотку смешиваем с находящимся в ней физиологическим раствором и 0,5 мл этого разведения переносим в четвертую пробирку, где также смешиваем с физиологическим раствором и из этого разведения 0,5 мл переносят в пятую пробирку, из которой после смешивания с физиологическим раствором 0,5 мл удаляем. Затем в каждую пробирку (2,3,4 и 5) вносим по 0,5 мл антигена, разведенного в соотношении 1:10 физиологическим раствором. После внесения антигена в каждой пробирке будет по 1 мл смеси, соответствующей разведениям 1:10, 1:20, 1:40, и 1:80.

4. Одновременно с постановкой реакции с испытуемыми сыворотками ставим контрольные реакции: с негативной сывороткой в тех же разведениях, как и испытуемые; с позитивной сывороткой в разведении до ее предельного титра.

5. После добавления к испытуемым и контрольным сывороткам антигена пробирки тщательно встряхиваем и ставим в термостат при температуре 37ºС на 16 часов, а затем выдерживаем при комнатной температуре в течение часа.

6. Результаты реакции учитываем макроскопически, оцениваем в крестах. Для испытуемой сыворотки: + едва заметное просветление, слабо выражен «зонтик» и при встряхивании жидкости заметно небольшое количество хлопьев. Для негативной сыворотки: — просветление не наблюдается, «зонтика» нет, при встряхивании образуется равномерная взвесь. Для позитивной бруцеллезной сыворотки: + + + просветление не полное, «зонтик» выражен хорошо, при встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, жидкость остается частично прозрачной. Делаем вывод, что сыворотка морских свинок не содержит антитела к бруцеллезному антигену.

После того, как мы провели РА и убедились в отсутствии в сыворотке антител, проводим заражение морских свинок. Для этого используем исследуемый материал, который предварительно растираем в ступке со стерильным физиологическим раствором. После осаждения грубых частиц, путем 5 мин центрифугирования при 1000 об/мин, суспензию вводим подкожно в дозе 1 мл. Для этого:

1. Пальцами левой руки оттягиваем кожу, в образовавшийся «кармашек» - складку вводим иглу шприца, затем его содержимое.

2. Место заражения – с медиальной стороны бедра.

На 40-е сутки берем кровь и исследуем в РА в разведении от 1:10 до 1:80. Результаты РА: + + + просветление не полное, «зонтик» выражен хорошо, при встряхивании «зонтик» разбивается на хлопья и комочки, жидкость остается частично прозрачной. Делаем вывод, что в сыворотке морских свинок содержатся антитела к бруцеллезному антигену.

Следующим этапом будет серологическое исследование. Для этого используем присланную кровь от коровы, получаем из нее сыворотку и ставим пластинчатую роз-бенгал пробу (РБП):

1. Используем 2 обезжиренных стекла с лунками. На первое – контрольное стекло при помощи микропипетки наносим 0, 03 см³ позитивной бруцеллезной сыворотки. На второе стекло вносим 0,03 см³ исследуемой сыворотки.

2. На оба предметных стекла при помощи пипетки-капельницы вносим такое же количество, что и сыворотки, бруцеллезного антигена.

3. Тщательно смешиваем стеклянной палочкой до получения однородной смеси, распределяя по всей поверхности лунки.

4. Стекла покачиваем в течение 4 мин осторожными вращательными движениями.

5. Проводим учет реакции невооруженным глазом: на стекле с позитивной бруцеллезной сывороткой и антигеном в течение 4 мин появляются крупные хлопья розового цвета на белом фоне – мы убедились, что бруцеллезный антиген действует. На стекле с исследуемой сывороткой через 4 мин также появляются хлопья розового цвета на белом фоне - делаем вывод, что реакция положительная и в сыворотке крови от коровы содержатся антитела к известному бруцеллезному антигену.

Следующим этапом наших исследований проводим дифференциацию видов, для этого исследуем бруцеллы на образование сероводорода. На печеночный агар (рН 6,6) засеваем взвесь культуры в пробирку, под пробку которой закладываем бумажку, пропитанную раствором уксуснокислого свинца. Посев помещаем в термостат при 37 ºС. Бумажка потемнела, что свидетельствует об образовании сероводорода. Из табл.1 приложения, мы видим, что свойствами образовывать сероводород и способностью расти в условиях повышенного содержания углекислого газа, способны только

B. abortus.