История изучения ферментов

История открытия и исследования ферментов весьма интересна. Вопросы о том, какова природа процессов в живом, каковы химические основы наблюдаемых превращений вещества, волновали всех великих химиков XIX столетия. Бурная дискуссия о природе химических реакций в живом развернулась между Луи Пастером (1822-1895), Юстусом фон Либихом и Марселеном Бертло (1827 - 1907). Луи Пастер был ярым сторонником того, что брожение (т. е. конверсию сахара в спирт или в уксусную кислоту и сопутствующие продукты) могут осуществить лишь живые клетки микроорганизмов. Л. Пастер отвергал саму идею необходимости существования растворимых ферментов, участвующих в брожении. А Ю.Либих, проводя различные химические реакции с органическими молекулами, не мог допустить мысли, что для реализации простого химического процесса - окисления спирта в уксусную кислоту (реакция идет под действием различных химических окислителей) - необходимо участие такого сложного агрегата, как целая клетка живого микроба. Ю.Либих предполагал, что наблюдается всего лишь корреляция между «физиологическим процессом» образования продуктов и ростом клеток.

Значительную роль в выяснении вопроса сыграла дискуссия между Л. Пастером и Марселеном Бертло. М. Бертло полагал, что процесс брожения осуществляется органической субстанцией дрожжей. Важным был эксперимент М. Бертло, в котором он разрушил клетки дрожжей, получил бесклеточный экстракт, переосадил eгo спиртом без существенной потери активности и доказал, что полученная субстанция обладает каталитическими свойствами. Этот эксперимент показал, что «фермент» и живые клетки микроорганизмов не одно и то же, продемонстрировал, что клетки содержат вещества, реально осуществляющие химическую реакцию. В конечном счёте Ю.Либих оказался прав. Известно, что конверсию этанола в уксусную кислоту осуществляют два фермента - алкогольдегидрогеназа и ацетальдегидрогеназа.

На то, что брожение имеет характер каталитического процесса, указывал Эйхальд Митчерлих (1794-1863). В 1843 г. он отмечал, что для проведения процесса сбраживания сахара необходимо незначительное количество дрожжей (менее 1 %), несоизмеримое с количеством конвертированного субстрата, т. е. вкладом дрожжей как вещества в материальный баланс реакции можно пренебречь. Дискуссия закончилась, но участники остались при своем мнении. Необходимо отметить: авторитет Л. Пастера был настолько высок, что eгo мнение, что лишь живые клетки микроорганизмов являются носителями процессов конверсии вещества, господствовала среди микробиологов длительное время. Его влияние на исследователей ощущалось и в ХХ в. Особую роль в дискуссии сыграла неоднозначность в терминах, существовавшая в те годы. В течение многих лет дрожжи называли ферментом. Л. Пастер был против распространения термина «фермент» на растворимые вещества, способные проводить конверсию caхара, а понимал под «ферментом» живые растущие клетки, осуществляющие образование этиленового спирта и СО₂. Термины «энзим» и «энзимолоrия» были ввeдeны в 1876 г. В. Кюном для обозначения «неорганизованных», «бесформенных» ферментов, таких как диастаза, пепсин, трипсин, известных уже тoгдa.

Точку в этом историческом споре поставили опыты Э. Бухнера (1897 г.), который продемонстрировал возможность проведения процесса брожения под действием бесклеточных экстрактов. Э. Бухнер механически разрушал клетки дрожжей, наблюдая за процессом под микроскопом, проводил экстракцию водой с отделением жидкости от твердых частиц фильтрованием под высоким давлением. Полученный раствор смеси ферментов был способен к интенсивному выделению спирта и СО₂ при введении eгo в раствор сaxapoзы. На реакцию не действовали классические антисептики. Опыты показали, что брожение - результат действия ферментов, не зависящего от целостности клетки. В 1907 г. Э. Бухнеру была присуждена Нобелевская премия по химии. Результатом работы большой группы исследователей, начиная с К. Кирхгофа, И. Берцелиуса, заканчивая В. Оствальдом и Э. Бухнером, явилось утверждение, что ферменты - это химические катализаторы и необходимо искать объяснения действия ферментов на химической основе.

Таким образом, стало ясно следующее: химический катализ и биологический катализ - это явления одного порядка; катализаторы обладают общим свойством - они способны ускорять химические реакции. При этом существуют как общие катализаторы, способные ускорять многие реакции (например, кислоты), так и специфические катализаторы, ускоряющие лишь узкий кpyг реакций и работающие с ограниченным набором субстратов. Последнее свойство характерно для ферментов.

Ферменты - очень эффективные катализаторы. По сравнению со свободно протекающими реакциями или реакциями с участием простых химических катализаторов, таких как, например, кислоты, скорость процессов под действием ферментов увеличивается примерно в 10¹² раз. Если ферментативная реакции протекает в течение 1 с, то на аналогичный процесс с участием протонов потребуется в 10¹² раз больше времени, т. е. 30000 лет. Очевидно, что ферменты определяют реальные временные характеристики биохимических процессов.

Ферменты - биологические катализаторы белковой природы. При этом ферменты не расходуются и не претерпевают необратимых изменений.

Каким образом ферменты повышают скорость реакций? Они ускоряют химические реакции, находя «обходные пути», позволяющие молекулам преодолевать активационный барьер на более низком энергетическом уровне. Это становится возможным потому, что ферментативная реакция состоит из 2-х стадий: на первой стадии происходит образование фермент-субстратного комплекса, переходному состоянию которого соответствует значительно более низкая энергия активации; на второй стадии этот комплекс распадается на продукты реакции и свободный фермент, который может взаимодействовать с новой молекулой субстрата. Это можно выразить следующим уравнением:

Е + S↔ ES → Р + Е,

где Е — фермент, S— субстрат, ЕS — фермент-субстратный комплекс, Р — продукты реакции.

Особенности ферментов. Ферменты, являясь по своей природе белками, обладающими третичной или четвертичной структурой, имеют ряд особенностей, которые отличают их от неорганических катализаторов. В первую очередь, это огромная сила каталитического действия. Ферменты в 10⁸—10²⁰ раз повышают скорость катализируемых ими реакций. Во-вторых, это специфичность действия ферментов. Они катализируют строго определенные реакции. (Только благодаря тончайшей специфичности ферментативного катализа возможна строгая упорядоченность и теснейшая взаимосвязь отдельных ферментативных реакций, лежащих в основе биологического обмена веществ).

По степени специфичности отдельные ферменты довольно сильно различаются между собой. Выделяют следующие основные типы специфичности:

— абсолютная специфичность - фермент катализирует превращение только одного субстрата;

— групповая специфичность - фермент действует на группу родственных субстратов, обладающих определенными структурными особенностями;

— специфичность по отношению к определенным типам реакций - такие ферменты обнаруживают наименьшую специфичность, они действуют независимо от того, какие группы присутствуют вблизи той связи, на которую направлено действие фермента;

— стереохимическая специфичность - фермент катализирует превращение только одной стереохимической формы субстрата.

Третьей особенностью ферментов, как биологических катализаторов, является их

лабильность. Они подвержены влиянию различных факторов и могут изменять свою активность под действием рН, температуры, присутствия активаторов и ингибиторов и др. Лабильность (или, иными словами, изменчивость) ферментов обусловлена их белковой природой, сложной пространственной конфигурацией (структурой).

Многие ферменты являются двухкомпонентными, то есть состоят из белковой части - апофермента и связанного с ним небелкового компонента - кофермента, участвующего в действии фермента в качестве обязательного кофактора. В результате ферментативных реакций коферменты, как правило, не подвергаются изменениям, однако при ряде последовательно протекающих реакций кофермент может представлять собой субстрат для отдельных ферментов, хотя и регенерируется, в конечном счете в исходной форме.

Химическая природа коферментов, их функции в ферментативных реакциях и механизм действия чрезвычайно разнообразны. Так, например, в качестве коферментов могут выступать витамины и их производные.

В соответствии с химическим строением коферменты можно подразделить на следующие группы:

а) коферменты алифатического ряда (глутатион, липоевая кислота);

б) коферменты ароматического ряда (коэнзим Q - убихинон);

в) коферменты - гетероциклические соединения (производные витаминов В₆, В₁ биотина - витамина Н, производные фолиевой кислоты);

г) коферменты - нуклеотиды и нуклеозиды (коэнзим А, НАД/НАДФ, ФАД/ФАДФ).

Единицы активности ферментов. Любой ферментный препарат прежде всего должен быть охарактеризован по его ферментативной активности. Комиссия по ферментам Международного Биохимического Союза рекомендует использовать следующие понятия и выражения единиц активности ферментов.

Стандартная единица фермента — это такое количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля данного субстрата за одну минуту при заданных условиях. Стандартная единица фермента обозначается буквой Е (от русского слова «единица») или буквой U (от английского слова «unit»).

Удельная активность — это число единиц (Е или U), отнесенное к одному миллиграмму белка в ферментном препарате. Количество белка в препарате фермента может быть определено любым известным методом определения белка (метод Кьельдаля, метод Лоури и др.).

Молекулярная активность — число молекул данного субстрата или эквивалентов затронутых групп, превращаемых за одну минуту одной молекулой фермента при оптимальной концентрации субстрата. Это понятие соответствует числу оборотов, введенных Вар-бургом. Число оборотов по Варбургу — это число молей превращенного субстрата, приходящееся на моль фермента за минуту. Для определения молекулярной активности фермента нужно знать его молекулярную массу.

Катал — каталитическая активность, способная осуществлять реакцию со скоростью равной 1 молю в секунду в заданной системе измерения активности. Каталитическая активность в 1 катал (кат) при практическом применении оказывается слишком большой величиной, поэтому в большинстве случаев каталитические активности выражают в микрокаталах (мккат), нанокаталах (нкат) или пикокаталах (пкат). Стандартная единица фермента находится с каталом в следующем соотношении: 1 Е (U) = 16,67 нкат.

Большое разнообразие ферментов и многообразие реакций, катализируемых ферментами, потребовало проведения классификации ферментов. В настоящее время известно более 3700 ферментов, различающихся по реакциям, которые они катализируют. В 1961 Международный биохимический союз принял классификацию и номенклатуру ферментов, которые являются общепринятыми в настоящее время. В качестве признака классификации ферментов принят тип кaтализируемой химической реакции. Ферменты были разделены по этому признаку на классы и далее на подклассы в зависимости от природы функциональных гpупп субстрата, участвующего в превращении. В свою очередь подклассы делятся на подподклассы в зависимости от природы фермента. Катализируемая химическая реакция представляет собой тот специфический признак, по которому один фермент отличается от другого. Поэтому естественно и логично, что классификация и номенклатура ферментов основывается на этом принципе. Современная классификация ферментов разработана специальной Комиссией Международного Биохимического Союза и изложена в книге «Номенклатура ферментов», которая вышла в русском переводе в 1979 г.

В основе классификации лежат три положения:

а) все ферменты делятся на 6 классов по типу катализируемой реакции;

б) каждый фермент получает систематическое название, включающее название субстрата, тип катализируемой реакции, и окончание «аза»; кроме того, Комиссией были сохранены и узаконены тривиальные названия. Таким образом, возникла двойная система наименования ферментов;

в) каждому ферменту присваивается четырехзначный шифр (код). Первое число указывает класс ферментов, второе - подкласс, третье - подподкласс, четвертое - порядковый номер фермента в подподклассе.

Например, алкоголъдегидрогеназа (Н.Ф. 1.1.1.1): первая цифра - 1 - означает класс оксидоредуктаз, вторая цифра - 1 - подкласс дегидрогеназ (действует на СН-ОН-группу доноров), третья цифра - 1 - подподкласс анаэробные дегидрогеназы (акцептором служит НАД⁺ или НАДФ⁺), четвертая цифра - 1 - конкретный фермент алкогольдегидрогеназа.

Или α-амилаза (Н.Ф.3.2.1.1): первая цифра - 3 - класс гидролаз, вторая цифра - 2 - подкласс карбогидраз, третья цифра - 1 - подподкласс полиаз, четвертая цифра - 1 - конкретный фермент α-амилаза.

Современная международная классификация ферментов делит все ферменты на 6 основных классов:

1 класс - оксидоредуктазы - ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции (присоединение О₂, отнятие и перенос Н₂, перенос электронов);

2 класс - трансферазы - ферменты переноса. Катализируют перенос целых атомных группировок с одного соединения на другое (например, остатков моносахаридов, аминокислот, остатков фосфорной кислоты, метальных и аминных групп и т.д.);

3 класс - гидролазы - ферменты, катализирующие реакции гидролиза, то есть расщепления сложных органических соединений на более простые с участием воды. Эти реакции могут быть выражены следующим уравнением:

RR₁ + НОН→ R-ОН + R₁-Н;

4 класс - лиазы - ферменты, катализирующие реакции негидролитического отщепления каких-либо групп от субстрата с образованием двойной связи или присоединение группировок по месту разрыва двойной связи (например, отщепление Н₂О, СО₂, NН₃ и т.д.);

5 класс - изомеразы - ферменты, катализирующие реакции изомеризации, то есть внутримолекулярного переноса химических группировок и образование изомерных форм различных органических соединений;

6 класс — лигазы (синтетазы) — ферменты, катализирующие реакции синтеза, сопряженные с разрывом высокоэнергетической связи АТФ и других нуклеозидтрифосфатов (при этом возможно образование С — С-; С — S-; С — О-; и С — N- связей).

Все известные ферменты были классифицированы на шесть классов: 1 - оксидоредуктазы, 2 - трансферазы, 3 - rидролазы, 4 - лиазы, 5 - изомеразы, 6 - лиrазы (или синтетазы). Название класса в большинстве случаев указывает на тип реакции, в которой участвует тот или иной фермент. Например, лиазы - это ферменты, которые катализируют отщепление от субстрата той или иной группы негидролитическим путем с образованием двойных связей. В обратном процессе лиазы катализируют присоединение по двойным связям. Ферменты класса лигазы (или синтетазы) катализируют присоединение двух молекул дрyг к дрyгy, сопряженное с расщеплением нуклеозидтрифосфатов. Номенклатура фермента складывается из нумерации класса, подкласса, подподкласса. Таким образом, первое число показывает, к какому классу из шести перечисленных выше относится данный фермент. Второе число характеризует природу функциональных групп субстрата. Например, в оксидоредуктазах это группа, подвергающаяся окислению; трансферазах - переносимая гpуппа; гидролазах - связь, подвергающаяся гидролизу; лиазах - связь, подвергающаяся реакции; изомеразах - тип реакции изомеризации; лигазах - связь, образующаяся в результате реакции.

Дополнительную информацию о химической реакции, в которой участвует фермент, дает третье и четвертое число.

Таблица. 1. Номенклатура ферментов, имеющих значение в пищевой промышленности [«Номенклатура ферментов», Рекомендации 1972г. — М, 1979 (под ред. акад. А. Е Браунштейна)]

Шифр	Систематическое название	Тривиальное название
Оксидоредуктазы
1.1.3.4	β-D-глюкоза: О2-оксидоредуктаза	Глюкозооксидаза
1.11.1.6	Н2О2: Н2О2-оксидоредуктаза	Каталаза
1.14.18.1	Монофенол, дигидрооксифенилаланин: О2-оксидоредуктаза	Монофенолоксидаза, полифенолоксидаза, тирозиназа, фенолаза
Гидролазы
3.1.1.3	Триацилглицерол — ацилгидролаза	Липаза, триацилглицероллипаза
3.1.1.11	Пектин- пектилгидролаза	Пектинэстераза
3.2.1.1	1,4-α-D-глюкакан глюканогидролаза	α-Амилаза
3.2.1,2	1,4-α-D-глюкан мальтогидролаза	β-Амилаза
3.2.1.3	1,4-α-D-глюкан глюкогидролаза	γ-Амилаза, глюкоамилаза
3.2,1.4	1,4-β-D-глюкан-4-глюкангидролаза	Целлюлаза
3.2.1.15	Поли-α- 1,4-галактуронид-гликаногидролаза	Полигалактуроназа
3.2.1.20	α-D-глюкозид глюкогидролаза	α-Глйкозидаза
3.2.1.21	D-глюкозид глюкогидролаза	β-Гликозидаза
3.2.1.23	β-D-глюкозид галактогидролаза	Лактаза, β-галактозидаза
3.4.23.1	—	Пепсин
3.4.23.4	—	Химозин (реннин)
3.4.21.4	—	Трипсин
3.4.21.1	—	Химотрипсин
3.4.22.5	—	Эластаза
3.4.21.1	—	Папаин
14.21.6	—	Химопапаин
14.22.6	—	Фицин
3.4.22.3	—	Бромелаин
3.4.22.14	—	Субтилизин
3.4.23.6	—	Кислая протеиназа
3.4.24.3	—	Коллагеназа
Изомеразы
5.3.1.9	D-глюкозо-6- фосфат- кетолизомераза	Глюкозоизомераза, глюкозофосфат-изомераза

Остановимся на рассмотрении отдельных представителей этих двух важнейших для пищевой промышленности классов ферментов с позиции описания их свойств, активности, механизма реакции и коснемся вопросов практического применения, которые будут рассмотрены более подробно в разделах, посвященных применению ферментов в конкретных пищевых технологиях.