32.Понятття загальної та комбінаційної здатності ліній.

Комбінаційної здатності, здатність лінії або сорту при поєднанні їх в різних гібридних комбінаціях давати в першому поколінні гібридів потомство, яке характеризується різним щодо деякого, умовно прийнятого рівня виразом тієї чи іншої ознаки або властивості. Взаємну поведінку двох особин, взятих для схрещування, вивчається шляхом визначення продуктивних можливостей їх нащадків в порівнянні з ін партнерами схрещування або з вільно запилюються різновидами. Комбінаційна здатність кваліфікується як генетичне властивість зі слабким індивідуальним дією. Розрізняють загальну і специфічну комбінаційну здатність.Загальна комбінаційна здатність - це комбінаційна здатність самоопиленних ліній або сортів, обумовлена ​​середньою величиною гетерозису у всіх досліджених гібридних комбінаціях з участю цих форм. Специфічна комбінаційна здатність - комбінаційна здатність самозапилення лінії або сорту, обумовлена ​​величиною гетерозису в якій-небудь конкретній комбінації. Якщо величина гетерозису в гібридній комбінації лінії з даною формою значно вище, ніж це можна було припускати на підставі загальної комбінаційної здатності лінії, говорять про високу специфічної комбінаційної здатності.

33.Біотехнології їх використання в селекції

Сучасна біотехнологія рослин — сума технологій, що розвинені із молекулярної та клітинної біології рослин — є новою стадією в розвитку

технології селекції рослин. З її допомогою поліпшення ознак може

проходити на рівні індивідуального гену. Окремі гени, які визначають

певну ознаку, можуть бути ідентифіковані, ізольовані, введені, виключені

або модифіковані в генотипі чи сорті рослини, за ними може проводитися

відбір.

Внесок біотехнології в рослинництво полягає в полегшенні традиційних

методів селекції рослин, розробці нових технологій, які дозволяють

підвищити ефективність сільськогосподарського виробництва. Методами

генної та клітинної інженерії створені високопродуктивні й стійкі проти

шкідників, хвороб та інших негативних чинників сорти

сільськогосподарських рослин. Розроблена техніка оздоровлення рослин від

інфекцій, що особливо важливо для культур, які розмножуються

вегетативно. Ведуться дослідження з поліпшення амінокислотного складу

рослинних білків, розробляються нові регулятори росту рослин,

мікробіологічні засоби захисту останніх від шкідників та хвороб,

бактеріальні добрива. Одним із актуальних питань біотехнології є

керування процесами азотфіксації та фотосинтезу, зокрема можливість

введення відповідних генів у геном культурних рослин.

На сучасному етапі розвитку для інтенсифікації селекції ефективним є

використання таких біотехнологічних методів: культура ізольованих

тканин, клітин та органів рослин, клітинна селекція та генна інженерія.

Вони дають можливість за короткий термін створити та розмножити цінний

вихідний високопродуктивний матеріал, гетерозисні гібриди та сорти

сільськогосподарських рослин. Розробка основ методу культури тканин

рослинних організмів має порівняно коротку історію і починається з

досліджень, виконаних Габерландтом у 1902 році. Проте кожне відкриття,

зроблене в цій галузі, знайшло використання в прикладних дослідженнях.

Усі проблеми, що вирішуються в культурі in vitro, можна поділити на три

основні групи:

збереження генетичної інформації клітин (мікроклональне розмноження та

депонування, культура зародків, пиляків і насіннєвих зачатків);

зміна генетичної інформації шляхом мутагенезу під впливом фізичних та

хімічних факторів (культура калусів, суспензій, протопластів);

перенесення та інтеграція генетичної інформації (генно-інженерне

конструювання рослин з новими ознаками, соматична гібридизація).

Одним із найпоширеніших напрямів методу культури тканин є мікроклональне

розмноження, при якому отримують генетично ідентичні форми, що сприяє

збереженню генетично однорідного посадкового матеріалу. Як експлант

можна використовувати пазушні бруньки, молоді листки, окремі елементи

квітів та суцвіть. Проте такий вид розмноження потребує конкретизації

для кожної сільськогосподарської культури через особливості її генотипу.

Технологія мікроклонального розмноження будь-якої культури включає

чотири основні етапи: введення вихідної форми в стерильну культуру,

власне мікророзмноження, укорінення розмножених пагонів, переведення.

34 Метод мікроклонального розмноження ,його переваги

Мікроклональне розмноження - це масове безстатеве розмноження в культурі in vitro, при якому отримані рослини ідентичні до вихідної батьківської форми.

Від традиційних методів розмноження рослин воно відрізняється такими особливостями:

1) отриманням великої кількості копій з мінімальної кількості вихідного матеріалу;

2) отриманням, залежно від мети дослідження, як генетично однорідного матеріалу, так і сомаклональних варіантів;

3) можливість відбирати in vitro рослинний матеріал з ознаками, що цікавлять дослідника;

4) можливість отримання безвірусного посадкового матеріалу при використанні як експланта апікальних меристем та проведення при необхідності термотерапії in vitro;

5) можливість проводити розмноження рослин протягом року, оскільки їх ріст та розвиток in vitro практично не залежать від сезонних змін.

Вперше мікроклональне розмноження було здійснено вченим Морелем (1960) при дослідженні орхідей Сутbidium. Модифіка¬ція цієї методики в даний час широко використовується для масового розмноження орхідних з комерційною метою, а також у виробництві таких культур, як картопля, гвоздика, суниці.

Мурасіге розділив весь процес мікроклонального розмноження на три стадії:

1) ініціація асептичної культури;

2) індукція численних пагонів при повторних пасажах на середовище для розмноження;

3) підготовка сформованих in vitro рослин до висадки в грунт.

У цілому, метод мікроклонального розмноження ґрунтується на індукованому цитокінінами розростанні верхівкових і пазушних меристем, кожна з яких дає початок багатьом пагонам. Після формування багатьох пагонів, їх розділяють на менші групи пагонів, переносять на свіже середовище, і процес повторюється.

Швидкість мікроклонального розмноження варіює залежно від виду рослини, але часто можна отримати з єдиної бруньки декілька мільйонів рослин за рік. Основними факторами, що впливають на процес мікроклонального розмноження, є тип експланту, склад поживних середовищ і умови культивування.

Вихідним матеріалом можуть служити верхівкові та пазушні меристеми стебла, молоді листки, елементи суцвіття та квітки, цибулини та бульбоцибулини. Ідеальним матеріалом для отримання численних пагонів є апікальні та пазушні бруньки здорових рослин, що активно ростуть.

У більшості випадків для мікроклонального розмноження використовують різноманітні модифікації середовища Мурасіге, Скуга, хоча деякі групи рослин можуть мати індивідуальні потреби в поживних речовинах. Культури можуть рости на агаризованих або на рідких поживних середовищах на мостиках із фільтрувального паперу.

Залежно від комбінацій умов культивування вихідної тканини (складу поживних середовищ, температури, світла), можна викликати розвиток пазушних бруньок, індукувати появу адвентивних бруньок або пагонів безпосередньо з клітин експланта або калусу.

Для індукції численних пагонів in vitro як експлант використовують верхівкові та пазушні бруньки. В той же час, широкого використання набула культура меристем. Додс і Робертс (1985) підкреслюють різноманітність понять «апікальна меристема» та «стебловий апекс», визначаючи апікальну меристему як ділянку стеблового апексу, що розташована дистально відносно наймолодшого листкового примордія і має довжину в середньому 80 мм. Незважаючи на деякі труднощі в роботі (необхідність маніпулювання мініатюрними експлантами, низький відсоток виживання in vitro), культури апікальних меристем широко використовуються для створення рослинного матеріалу, що вільний від патогенів.

Мікроклональне розмноження проводять шляхом вичленення апікальної меристеми. У даному методі за основу покладена здатність рослинних фрагментів, що мають точку росту, до відтворення материнського організму. В 1949 р. встановлено, що апікальна частина точки росту (0,1 мм), що складається з ще недиференційованих клітин (меристема), здатна нести генетичну інформацію організму, але не містить вірусних часток, які присутні в диференційованій клітині дорослого організму. Поміщена на поживне середовище, меристема виростає з утворенням нового організму рослини, який не містить вірусів. Таку рослину легко швидко розмножити, розділивши на пагони (4-6), які містять точки росту. Клонуванням наступних поколінь меристемних рослин одержують клон материнського організму з тією ж генетичною інформацією, але без вірусних часток.

У багатьох випадках ефективним способом розмноження in vitro може служити соматичний ембріогенез, тобто, процес формування зародковоподібних структур (ембріоїдів), що розвиваються із соматичної клітини, і можуть дати початок цілій рослині. Соматичний ембріогенез індукують двома різними шляхами: прямим та непрямим. У ході прямого ембріогенезу соматичні зародки формуються безпосередньо в тканині екаспланту без проліферації калусу. Сформовані таким чином рослини ідентичні до батьківської форми. Непрямий шлях соматичного ембріогенезу пов'язаний із формуванням ембріоїдів з дедиференційованих калусних клітин і включає такі етапи:

1) індукція проембріогенної калусної маси;

2) розвиток ембріоїдів з проембріогенних клітин;

3) проростання ембріоїдів і формування рослин.

Серед рослин, що регенерували шляхом непрямого ембріогенезу, нерідко зустрічаються форми, що відрізняються від вихідних. Сомаклональні варіанти, що виникли таким, чином можуть бути використані у подальшій селекційній роботі.

Вегетативне розмноження in vitro

Зелені пагони асептичних рослин розрізають на живці довжиною 3-5 мм з однією пазушною брунькою і поміщають в пробірки або колби із середовищем МS. Для пригнічення бактеріального зараження в культурі in vitro на першому етапі культивування можна вводити у склад поживних середовищ антибіотик, наприклад, клафоран. Розчин антибіотику попередньо стерилізують через мембранний фільтр і добавляють в поживне середовище, охолоджене до +40°С.

Культивування проводять на світлі при температурі +25-+28°С. Живці вкорінюються і дають пагони протягом 3-4 тижнів після введення в культуру. Отримані пагони можна розмножу¬вати шляхом живцювання і вирощувати на безгормональних середовищах або середовищах, що містять низькі концентрації ауксинів (0,1-0,2 мг/л ЮК).

Методика мікроклонального розмноження

Швидке мікроклональне розмноження включає декілька етапів.

1. Індукція адвентивних бруньок.

Верхівкові та пазушні бруньки простерилізованих пагонів поміщають в колби Ерленмейєра в 5 мл рідкого поживного середовища МS, Уайта або Гамборга з БАП в концентрації 4-6 мг/л і культивують на світлі при 25-28°С протягом 2-3 тижнів. Цього часу достатньо для зняття апікального домінування. Починається інтенсивна проліферація адвентивних бруньок.

2. Формування пагонів.

Після 2-3 тижнів культивування експланти переносять на рідке поживне середовище того ж складу, але із зниженим вмістом БАП (до 2 мг/л). На цьому середовищі через 1,5-2 тижні починається інтенсивне утворення пагонів. Пасажування (перенесення) на свіже середовище проводять через кожні два тижні.

3. Вкорінення пагонів та формування рослин.

Сформовані пагони вичленяють із проліферуючих експлантів та пересаджують в окремі пробірки на тверде середовище МS з низькими концентраціями IOК (0,1-0,2 мг/л) для вкорінення. Повністю сформовані рослини висаджують у грунт.

Розмноження рослин шляхом вичленення апікальної меристеми

1. Готують поживне середовище Мурасіге, Скуга.

2. Вичленення меристеми проводять у боксі з ламінарним потоком повітря. Кінець стебла (4-5 мм) відрізають і поміщають у поле зору мікроскопа. Під мікроскопічним контролем пінцетом із спеціальним пристроєм відрізають 0,2-0,5 мм апікальної частини стебла і відокремлюють кінцеву неклітинну недиференційовану масу - близько 0,1 мм від верхнього кінця.

3. Висадка і вирощування.

У стерильних умовах пробірки із стерильним поживним середовищем відкривають, нахиляють під кутом 45° і користуючись стерильним пінцетом, меристему занурюють у поживне середовище. Пробірки закривають ватними пробками і переносять в термальну кімнату із температурою повітря +25-+35°C та цілодобовим освітленням люмінесцентними лампами. Через 2-3 тижні із меристеми виростає рослина.

4. Вирощені із меристеми рослини в стерильних умовах виймають із пробірок і живцюють таким чином, щоб кожний із живців мав точку росту.

Одержані живці висаджують у поживне середовище. Через 1-2 тижні із них виростають рослини

35 Соматична гібридизація,її основні напрями

[від грец.— тіло; сукупність] — злиття двох або кількох соматичних клітин (нестатевих) у одну загальну клітину. Може відбуватися в живому організмі або при штучному культивуванні клітин. Експериментальним шляхом можна сполучити в одній клітині різні геноми, що належать до найвіддаленіших у систематичному відношенні організмів, між якими статева гібридизація неможлива. Одержані такі віддалені гібриди соматичних клітин: людини і кролика, людини і комара, людини і моркви, корови і норки, курки і дріжджів та ін. Тепер практично можливо одержати гібриди будь-яких двох або більше клітин. Такі гібридні клітини можна виділити в процесі селекції й підтримувати у вигляді чистої культури (див. Культура тканин). При С. г. можуть виникати як істинно гібридні клітини (коли зливаються і ядра), так і гетерокаріони (зливається цитоплазма; ядра залишаються відокремленими). Гетерокаріони виникають при злитті клітин філогенетично віддалених організмів (напр., тваринного і рослинного); вони не здатні до поділу, але довго залишаються життєздатними. Для збільшення здатності тваринних клітин до С. г. їх обробляють інактивованим вірусом Сендай; рослинні клітини перетворюють на протопласти, руйнуючи їхню клітинну оболонку ферментами. С. г. широко застосовують для дослідження генетич. основ різноманітних біол. явищ, зокрема для картування генів (див. Генетичні карти хромосом) в хромосомах (напр., людини), генетичного аналізу соматичних клітин вищих організмів з метою вивчення клітинного диференціювання, природи злоякісних пухлин і пригнічення їхнього росту тощо. В селекції рослин С. г. може мати в майбутньому велике значення для вирощування із злитих протопластів гібридних форм видів, що не схрещуються між собою.