Принцип работы прибора

Нижняя часть колонки (2-1) при закрытом затворе заполняется физиологическим раствором, сверху укладывается фильтр, который зажимается при соединении двух частей колонки путем навинчивания части 2-2 на часть 2-1. Поверхностное натяжение, создающееся на порах фильтра удерживает жидкость в нижней части колонки. Рабочая часть колонки (2-2) при закрытом затворе заполняется доверху электропроводящей жидкостью (суспензией клеток или ресуспендирующим раствором). Сверху помещается датчик (надевается как колпачок до упора на рабочую часть колонки), соединённый с электронным блоком регистрации. Если на табло блока регистрации были какие-нибудь показания, то при погружении всех трёх электродов в жидкость они автоматически сбрасываются на нуль (обнуляются). Затвор блока фильтрации подпружинен и открывается резко, щелчком. При открывании затвора под действием силы тяжести жидкость начинает вытекать через фильтр, соответственно опускается её уровень в верхней (рабочей) части колонки.

При опускании жидкости ниже уровня короткого электрода (что соответствует вытеканию примерно 30 мкл. раствора) автоматически начинается отсчёт времени на табло блока регистрации. При опускании жидкости ниже уровня остальных двух электродов (что соответствует вытеканию ещё 250 мкл) отсчёт времени автоматически останавливается. Показания на табло (время фильтрации 250 мкл жидкости) сохраняются до следующего замыкания всех электродов (следующего измерения).

Благодаря конструкции блока регистрации и датчика исключается влияние степени поляризации и растворения электродов на результаты измерений, а также влияние самого датчика на суспензию клеток.

Ход определения ( получение фильтрационно-осмотической кривой)

а) приготовление растворов с различной осмолярностью

Сначала готовят два исходных раствора с крайними значениями осмолярности (А=145±5 мОсм и Б=295±5 мОсм) и физиологическим значением рН (7,40±0,05). рН поддерживается буферным раствором (HEPES 10 мМ). Поскольку объем эритроцитов зависит от рН, постоянство этого параметра является необходимым условием измерений. Для измерения осмолярности используется криоскопический осмометр.

Для приготовления гипотонического раствора А с осмолярностью 145±5 мОсм берут две навески:

NaCl – 2,X г ;

HEPES - 2, Y г.

NaCl переносят в стакан, добавляют 500 – 600 мл дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. Затем к раствору NaCl добавляют HEPES и продолжают перемешивать до полного растворения. Затем доводят объем дистиллированной водой до 990 мл и титруют раствором 0,1 М NaOH до рН 7,40±0,05. Затем переносят раствор в мерную колбу емкостью 1 л, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтр с порами 0,45 мкм, затем

измеряют рН и осмолярность. Готовый раствор хранят в холодильнике.

Изотонический раствор Б готовят так же, как раствор А, но навеска

NaCl = 8, X г.

Из растворов А и Б смешивая их в определенных соотношениях готовят рабочие растворы с требующейся осмолярностью U по формуле:

U = (X частей А + Y частей Б)/(X+Y).

Подбирая X и Y можно приготовить растворы со значениями осмолярности от А до Б. Удобно готовить растворы с помощью пипеточного дозатора (Табл 1).

Таблица 1.

Осмолярность раствора U, мОсм	Количество частей раствора А с осмолярностью 150 мОсм	Количество частей раствора Б с осмолярностью 300 мОсм
300	0	1
283	1	8
275	1	5
262,5	1	3
250	1	2
225	1	1
200	2	1
187,5	3	1
180	4	1
171	6	1
150	1	0

Pекомендуется перед проведением измерений профильтровать ресуспендирующий раствор через фильтр с порами 0,2 – 0,4 мкм для удаления взвешенных частиц (пыль, бактерии), влияющих на измерения. Контролем годности раствора для работы является воспроизводимость результатов измерений с точностью до 0,1 сек.

б) подготовка образцов эритроцитов

Для исследования используется капиллярная или венозная кровь, взятая на гепарине, ЭДТА или цитратном растворе. Суспензию эритроцитов для измерения фильтруемости готовят из цельной крови. Если содержание лейкоцитов и тромбоцитов превышает норму, то следует удалить тромболейкоцитарный слой.

Непосредственно перед измерением кровь разбавляют рабочим раствором до гематокрита 0.1-1.0 %.

в) фильтры

В большинстве фильтрационных систем используют поликарбонатные мембранные фильтры. Такие фильтры получают травлением треков после облучения тяжелыми частицами, разогнанными в циклотроне. Диаметр пор фильтров обычно составляет 3 или 5 мкм. Сопротивление фильтров с порами диаметром 3 мкм более чувствительно к изменению отношения S/V, а сопротивление фильтров с порами диаметром 5 мкм более чувствительно к увеличению концентрации и вязкости внутриклеточного гемоглобина. Недостатком поликарбонатных мембранных фильтров является гетерогенность пор, различающихся по диаметру и плотности распределения на фильтре и наличие двойных и тройных пор (Рис.2). Как показано в рботе [8] это приводит к зависимости F от гематокрита. Поэтому сопоставлять значения F можно только проводя измерения при одинаковом гематокрите.

Рис.2 Мембранный фильтр производства ОИЯИ (Дубна). Диаметр пор 3 мкм, толщина пленки 7 мкм.

Рис.3. Фильтр Nickel-Mesh .Диаметр пор 3-4 мкм, толщина пластинки 11 мкм [9]

г) проведение измерений

При закрытом затворе и установленном фильтре заполнить резервуар ресуспендирующим раствором вровень с краями. Установить датчик на резервуар, надев его до упора. Убедившись, что на табло блока регистрации установлены нули открыть затвор. При этом цифровые показания на табло должны изменяться в сторону увеличения.

После остановки на табло отсчета времени (показания более не меняются) закрыть затвор и занести показание в рабочий журнал, обозначив эту величину как время протекания 250 мкл ресуспендирующего раствора через фильтр – tb (время протеания буфера). Затем закрыть затвор, снять датчик (фильтр не снимать!!!), долить ресуспендирующий раствор в резервуар и повторить измерение tb (время протекания буфера). Измерение tb с одним фильтром следует проводить до тех пор, пока значения tb не перестанут меняться.

После полного опоражнения рабочей части колонки закрыть затвор, заполнить резервуар свежеприготовленной суспензией эритроцитов, установить датчик и измерить время протекания через тот же фильтр 250 мкл суспензии, обозначив его в журнале, как ts (время протекания суспензии). При ts > 100 сек измерение останавливают, поскольку tb/ ts при этом приближается к 0.

Перед каждым измерением фильтр промывают физиологическим

раствором. Для этого при закрытом затворе удалить пипеткой остатки суспензии. Затем несколько раз заполнять рабочую часть колонки физиологическим раствором и удалять его с помощью пипетки, стараясь не повредить фильтр.

Для каждой пробы крови измерение ts желательно проводить не менее 3-х раз, перед каждым измерением отмывая (или меняя) фильтр. Если при вытекании из колонки жидкости наблюдается безостановочное изменение показаний на табло, или при снятом с резервуара датчике показания самопроизвольно сбрасываются на нуль, то необходимо промыть крышку датчика и электроды дистиллированной водой и тщательно их высушить (можно при температуре 50-60⁰С).

После окончания работы фильтр удалить, колонку промыть водой.

д) построение фильтрационно-осмотической кривой

Фильтрационно-осмотическую кривую строят в координатах: по оси Х – осмолярность среды - U, по оси Y – соответствующее значение фильтруемости эритроцитов - F=t_b/t_s (средняя скорость протекания суспензии эритроцитов через фильтр (v_s/t_s), нормированная на среднюю скорость протекания буфера v_b/t_b).

Экспериментальные точки соединяют отрезками прямой, экстраполируют к нулевому значению F и определяют значение осмолярности, при котором F=0 (Ucr - критическая осмолярность). F=0, когда все поры фильтра перекрыты нефильтрующимися клетками. В число нефильтрующихся клеток попадают также медленно фильтрующиеся эритроциты, которые за время измерений (не более 100 сек) не успевают профильтроваться. Это происходит, когда количество нефильтрующихся эритроцитов в суспензии равно количеству пор на рабочей поверхности фильтра. Процентное содержание нефильтрующихся клеток (Z%) при значении осмолярности равном Ucr рассчитывается по формуле:

Z% = 100 * N₀/n %, где

N₀ – количество пор на рабочей поверхности фильтра,

n – количество эритроцитов в протекшем объеме.

Результаты измерения фильтруемости эритроцитов зависят от диаметра пор и от толщины фильтра. Поэтому для каждого типа и даже для каждой серии фильтров норма должна быть определена в специальной серии экспериментов.

Приведенные ниже результаты исследования фильтруемости эритроцитов выполнены на фильтрах с диаметром пор 3 мкм, толщиной 7 мкм и

N₀=6 – 9 *10⁵. В протекшем объеме (250+30 мкл) при гематокрите 0,1% содержится приблизительно 3,1*10⁶ эритроцитов со средним объемом 90 fl. Следовательно, для перекрывания всех пор фильтра в суспензии эритроцитов должно содержаться 20-30% нефильтрующихся клеток. При гематокрите 1% для перекрывания всех пор фильтра достаточно 2-3% нефильтрующихся клеток. Поскольку в крови даже в норме присутствует около 1% патологически измененных эритроцитов, измерение при более высоких гематокритах нецелесообразно, поскольку будет являться характеристикой минорной фракции эритроцитов. При сильно ухудшенной фильтруемости эритроцитов можно проводить измерения при меньших гематокритах.

Применение ФИОМ

1. В клинической практике

а) исследование деформируемости эритроцитов;

б) диагностика анемий;

в) динамическое наблюдения за состоянием больного;

г) регистрация и объяснение патологических процессов, происходящих в организме;

2. В службе крови для контроля качества эритроцитов, предназначенных для трансфузий.

3. В исследовательской работе в качестве метода изучения биофизических свойств эритроцитов.

Примеры фильтрационно-осмотических кривых

Рис.4. Усредненные ФИО кривые контрольной группы доноров

Примеры фильтрационно-осмотических кривых при различных заболеваниях.