6.Культивирование и размножение вирусов

По способу существования вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами. В естественных условиях они могут репродуцироваться только в клетках восприимчивых организмов. Внесенные на питательные бактериологические среды, вирусы не проявляют никаких признаков жизнедеятельности.

Культивирование фитопатогенных вирусов. Для поддержания культуры фитопатогенных вирусов удобно использовать восприимчивые растения, выращи­ваемые в теплицах. При работе с однолетними растениями культура вируса может длительно поддерживаться путем пасадкой с растений, заканчивающих вегетацию, на вновь выращенные молодые растения. Это легко осуществляется в тех случаях, когда вирус переносится при посредстве механической инокуляции инфекционного сока.

Для вирусов, передающихся в природе только при посредстве насекомых, пасадки можно проводить путем прививки черенков больных растений на здоровые или используя для этого насекомых-переносчиков.

Многие вирусы культивируются также в изолирован­ных органах. Чаще для этого служат листья, но могут быть использованы и стебли, и корни восприимчивых растений. Зараженные листья выдерживаются во влаж­ных камерах при подходящей температуре.

Культивирование бактериофагов. Бактериофаги культивируются в клетках восприим­чивых бактерий. При литическом действии бактериофага культура его поддерживается путем заражения фаголизатом новых бактериальных засевов. В тех случаях, когда восприимчивые бактерии в ответ на заражение бактерио­фагом легко переходят в лизогенное состояние и также легко впоследствии выделяют активный бактериофаг при действии ультрафиолетового облучения или некоторых хи­мических реагентов, культура его может поддерживаться неопределенно долго путем простых пересевов.

Культивирование вирусов, патогенных для человека и животных.

Многие вирусы, патогенные для человека и животных, хорошо культивируются в развивающемся курином эмб­рионе. К ним относятся вирусы вакцины, бешенства, свинки, кори, герпеса и ряд других. Для инокуляции вируса чаще всего используется обо­лочка, желточный мешок и неко­торые другие части эмбриона.

Инокуляции подвергаются оплодотворенные яйца, прошедшие инкубирование при 38° С в течение 3—13 дней. Подходящий возраст эмбриона определяется в зависимо­сти от особенностей данного вируса, а также от того, какой орган избирается для инокуляции. Для нанесения вирусного материала на оболочку она обнажается путем удаления небольшого участка скорлупы и разрыва скорлуповой оболочки. Нужное для операции место определяется при просвечивании яйца. Вскрытый участок скорлупы после заражения закрывает­ся покровным стеклом, края которого заливаются пара­фином.

После инокуляции яйца инкубируются при 36° С, и в них размножается вирус.

Для накопления вирусов широко применяются также культуры нормальных и опухолевых тканей. Наиболее распространен способ однослойной культуры тканей на стекле. Питательная среда содержит плазму или сыво­ротку крови, к которым в некоторых случаях прибавляют экстракт куриного эмбриона. Добавляется также сбалан­сированный солевой раствор.

Размножение фитопатогенных вирусов. Проникнув в результате инокуляции в клетки расте­ния-хозяина, фитопатогенные вирусы размножаются, пре­терпевая при этом цикл развития, включающий каче­ственно различные стадии, или фазы. Весь цикл развития вирусов пока не исследован. Наиболее изучен в этом отно­шении вирус табачной мозаики.

В развитии этого вируса отчетливо выделяются две фазы, хотя в действительности их, возможно, больше: вегетативная фаза и фаза покоя.

Вегетативная фаза, во время которой вирус размно­жается, наступает через 1—2 ч после заражения воспри­имчивого хозяина в условиях оптимальной температуры (Сухов и Капица, 1956). Размножаясь вначале в отдель­ных клетках, вегетативный вирус по плазмодесмам про­никает в смежные клетки, где также размножается. Попав в ту или иную клетку, вегетативный вирус размно­жается в ней не беспредельно, а ограниченное время, длящееся приблизительно 9—10 ч. Только после этого в данной клетке вирус переходит из фазы размножения в фазу покоя.

Переход в фазу покоя обусловлен исчерпыванием субстратов, необходимых для размножения вируса, или же накоплением продуктов обмена, тор­мозящих его дальнейшее размножение.

Вегетативный вирус по ряду свойств отличается от по­коящегося. Характерным отличием является его неспо­собность заражать новые растения при использовании обычных методов инокуляции. Вегетативный вирус прак-тически лишен контагиозности, что объясняется быстрой его инактивацией при разрушении тканей в момент при­готовления инокулюма.

Установлено, что при выдерживании листьев с накоп­ленным в них вегетативным вирусом в течение 2—3 ч при 28° С в них появляется значительное количество инфекционного вируса.

Течение инфекционного процесса в клетке сопровож­дается определенными изменениями в ее органоидах. По данным Виттштейна и Цеха (1962), первая фаза репродукции ВТМ характеризуется усилением синтеза нуклеи­новых кислот в ядре и увеличением размеров последнего. Эти изменения становятся заметными уже через 30 мин после заражения и прогрессируют в течение следую­щих 2—3 ч.

Ядро при этом пронизывается системой цитоплазматических каналов, окаймленных ядерной мембраной. В каналах находятся митохондрии, мембраны Гольджи или эндоплазматического ретикулума. Через 3—7 ч после заражения в цитоплазме, окаймляющей ядро, появляется материал, абсорбирующий ультрафиолетовые лучи в об­ласти волн, поглощаемых нуклеиновыми кислотами. К кон­цу этого периода содержание нуклеиновых кислот в ядре падает и абсорбирующий материал из области, окружаю­щей ядро, рассеивается в цитоплазме. Масса цитоплазмы при этом увеличивается. В ней интенсивно накапливаются митохондрии, элементы Гольджи, эндоплазматический ретикулум и другие цитоплазматические органоиды.

Начиная с 9-го ч после заражения, в цитоплазме накапливается вирусный белок, участвующий в образова­нии спирализованных вирионов ВТМ, и к 25-му ч форми­руются новые кристаллические включения вируса.

Размножение бактериофагов. Процесс заражения бактерио-фагом бактериальной клет­ки начинается с адсорбции вирионов бактериофага на ее оболочке.

Бактериофаги на бактериальных клетках адсорби­руются при всех градациях температуры от 0 до 37° С. Однако бактериофаг при низкой температуре исторгает генеративный материал не в клетку, а в окружающую среду и заражения бактерии не происходит.

Инъекция ДНК бактериофага в бактериальную клетку происходит замедленно при 37° С и сильно ускоряется при 44° С, что связано с уменьшением вязкости нуклеиновой системы.

При гидро­лизе участка бактериальной оболочки, вызываемом фер­ментом прикрепившегося бактериофага, появляются веще­ства со свободными аминогруппами. Предполагается, что эти вещества вызывают исторжение ДНК (Гарен и Коз­лов, 1959).

Бактериофаги, имеющие спермиеобразную форму, адсорбируются на бактериальной оболочке концом хвостовидного придатка. В результате действия ферментной системы, заклю­ченной в хвостовидном отростке, целостность оболочки нарушается, образуется отверстие, через которое в цито­плазму клетки исторгается внутреннее содержимое кор­пускулы, состоящее у бактериофага из ДНК, белка и аргининсодержащего вещества. Основную массу гене­ративной системы составляет нуклеиновая кислота.

После внедрения генеративного материала в цитоплаз­му бактерии наступает латентный период инфекции, в течение которого бактериофаг находится в состоянии размножения. Разные формы бактериофага имеют раз­личную продолжительность латентного периода.

В вегетативной фазе развития бактериофаг не обладает приспособлениями, необходимыми для внедрения в новые бактериальные клетки, и поэтому неинфекционен. Если механически разрушить бактериальные клетки, несущие вегетативный бактериофаг, и внести этот материал в куль­туру восприимчивых бактерий, лизиса не наступает. неспособен заражать новые бактериальные клетки.

После проникновения генеративной системы бактерио­фага в клетку начавшийся инфекционный процесс прояв­ляется прежде всего в разрушении нуклеоидов бактерии. В это же время начинается синтез ДНК бактериофага. В различных участках клетки образуются вакуоли, заполняющиеся тонким фибриллярным материалом, состоя­щим из рыхло расположенных нитей вирусной ДНК. Эти области имеют непра­вильные очертания, но они ограничены и фибриллы не сме­шиваются с рибосомами цитоплазмы.

В местах скопления фибрилл образуются плотные тельца, по величине близкие к головке бактериофага, но лишенные белковой оболочки. Их образование связано с конденсацией индивидуальных цепей ДНК. В это время в участках скопления указанных частиц сосредоточены значитель­ные массы белковых субъединиц. В краткий период вре­мени, длящийся около 1 мин, происходит формирование белковой оболочки, окружающей каждое нуклеиновое тельце. В следующие 5 мин завершается созревание частиц бактериофага, и они приобретают свой характер­ный вид.

Размножение зоопатогенных вирусов. Довольно хорошо изучен процесс репродукции малых, содержащих РНК энтеровирусов, к которым относятся вирусы полиомиелита, Коксаки и др.

Первый этап инфекции вируса полиомиелита связан с адсорбцией вирионов на поверхности восприимчивых клеток. Адсорбция специфична и происходит только на клетках тканей приматов и человека. На клетках других млекопитающих вирионы этого вируса не адсор­бируются. Вызывающий адсорбцию рецептор в оболочках клеток приматов представлен специфическими липопротеидами. Специфичность адсорбции обусловлена свой­ствами белковой оболочки вириона. Инфекционная РНК вируса, выделенная из вирионов, лишена этой специфич­ности и может вызвать заражение клеток в культуре тка­ней млекопитающих, относящихся к разным отрядам. Однако после прохождения одного цикла развития вновь образовавшиеся вирионы неспособны возобновить инфек­ционный процесс в культурах тканей этих животных.

После адсорбции вирионов на плазматических мембра­нах клеток в культуре тканей происходит нарушение целостности капсиды с освобождением вирусной РНК. Этот материал проникает внутрь клетки посредством пиноцитоза, т. е. вовлечения частиц внутрь цитоплазмы в результате образования глубоких впячиваний мембраны, преобразующихся затем в мелкие вакуоли.

Латентный период инфекции вируса полиомиелита длится 2,5—3 ч. В это время в клетках протекают следую­щие процессы. РНК вируса связывается с рибосомами и при посредстве их аппарата индуцирует синтез специ­фической вирусной репликазы. Последняя, взаимодей­ствуя с вирусной РНК, катализирует синтез новых цепей РНК. Несколько позже, используя рибосомы, вирусная РНК индуцирует синтез белков, необходимых для обра­зования оболочки вирионов.

Процесс объединения цепей РНК и белковых субъеди­ниц в структуру вирионов происходит в конце латентного периода и определяется, вероятно, физической комплементарностью этих компонентов.

Таким образом, рибосомы являются теми органоидами клетки, где вирусная РНК осуществляет паразитическую функцию и организует синтез вирусных белков.

Латентные вирусные инфекции. Латентное носительство вирусов, когда их присутствие в организме хозяина не проявляется никакими внешними симптомами, широко распространено в природе.

Например, у картофеля обнаружен вирус S, выявляе­мый серологически и при посредстве электронного микро­скопа, но не вызывающий заметных симптомов. К латент­ным вирусам относится также «маскированный» штамм вируса табачной мозаики, выделенный Холмсом (1934) в опытах по температурной изменчивости вируса. Расте­ния табака, зараженные этим штаммом, выглядят как здоровые, но в их тканях постепенно накапливается высокая концентрация вируса.

Среди вирусов, патогенных для животных, также известны латентные формы. Например, вирус подчелю­стных желез морской свинки часто присутствует у внеш­не здоровых животных. В клетках желез он образует харак­терные внутриядерные включения. При подкожном зара­жении свинок материалом из инфицированных желез не возникает никаких внешних симптомов, но в ядрах подчелюстных желез вскоре появляются включения. Только при интрацеребральном введении такого материала молодым животным возникает тяжелое поражение, и через 5—7 дней они погибают.

Латентная инфекция наблюдается также при распро­странении простого герпеса. Вирус герпеса присутствует у очень большого числа людей, изредка проявляясь в виде «лихорадки» или мокнущих пузырьков в области губ и ротовой полости. Заражение вирусом происходит в раннем детстве, когда он вызывает незначительные симп­томы афтического стоматита. После выздоровления вирус остается в организме неопределенно долгое время, нахо­дясь в латентном состоянии. При действии некоторых провоцирующих внешних факторов латентное состояние нарушается, и возникают герпетические поражения.

Явление латентной инфекции характеризуется наибо­лее уравновешенными отношениями между хозяином и паразитом и обеспечивает для последнего наилучшие условия для выживания и распространения в природе. Еще более совершенную форму взаимоотношений пред­ставляет симбиоз, когда организм хозяина получает какие-либо преимущества от поселившегося в нем симбион­та. В случае фито- и зоопатогенных вирусов положитель­ное значение для хозяина может иметь бессимптомное носительство непатогенных штаммов, обеспечивающее ин­фекционный иммунитет против высоковирулентных штам­мов. Такое же значение имеет лизогенность бактерий, сопряженная с иммунитетом против лизирующего бакте­риофага.

ВЛИЯНИЕ АНТРОПОГЕННЫХ

ФАКТОРОВ НА МИКРОБНОЕ

СООБЩЕСТВО ПОЧВЫ

1. Обработка почвы. Мелиорация

2. Органические удобрения

3. Минеральные удобрения

4. Химические средства защиты растений

Среди антропогенных факторов наибольшее влияние на микробное сообщество почвы имеют разнообразные приемы обработки, мели­орация, органические и минеральные удобрения и химические средства защиты растений (пестициды).