Выработка условно-рефлекторного замирания.
Из-за технической неполадки в камере одно из животных при обучении пришлось держать не 3 минуты, а чуть больше. Остальные животные обучались в исправной камере. При тестировании также из-за технических неполадок запись одной мыши не получена.
Рис.
1. Процент времени замирания животного
от общего времени нахождения в камере.
По оси ординат – проценты. Различия не
достоверны (непараметрический критерий
Манна-Уитни, p>0,05).
Обнаружена тенденция к увеличению времени замираний у обучившихся животных.
Измерение уровня индуцированной флуоресценции коры больших полушарий.
Рис. 2. Уровень индуцированной флуоресценции в коре больших полушарий после обучения (ОП) и у контрольной группы (ПК). По оси ординат – уровень флуоресценции, в ph/s/cm2/sr *10^5.
Рис. 3. Вид мозгов в приборе photon imager при съёмке уровня флуоресценции в коре больших полушарий. Верхний ряд – ПК, нижний – ОП. Красным выделена область, в которой происходило точное измерение уровня флуоресценции.
Экспрессия zif268 в ca1 дорзального гиппокампа, цингулярной коре.
В программе ImagePro провели подсчёт плотности клеток с повышенным уровнем экспрессии zif268 в поле CA1 дорсального гиппокампа (-1,94 – -1,34 мм от Брегма) и зонах cg1 и cg2 (цингулярная кора) (-0, 34 – 0,98 мм от Брегма).
Рис. 4. Пример клетки (указано стрелкой), в которой экспрессия считалась повышенной. Цингулярная кора, мозг из группы ПК.
Рис. 5. Количество клеток на квадратный миллиметр, имеющих повышенный уровень экспрессии zif268 цингулярной коре и ca1 дорзального гиппокампа у опытной (ОП) и контрольной (ПК) групп.
Анализ генотипирования.
500 п.н.
Рис. 6. Вид электрофоретического геля с 15 пробами. Слева направо: step ladder (яркая полоса снизу– 500 п.н.); c-fosGFP; wild type (WT); WT; WT; c-fos GFP; c-fos GFP; zif GFP; zif GFP; zif GFP; zif GFP; zif GFP; zif GFP; ПЦР-контроль (без ДНК), step ladder. Стрелкой указано направление движения ДНК.
ПЦР прошла во всех интересующих нас пробах. По результатам электрофореза можно сказать, что zif-GFP по массе не отличается от GFP у c-fos трансгенных мышей (примерно 300-400 пар нуклеотидов) – самая яркая полоска снизу. Обнаружение более лёгкой формы GFP у некоторых zif мышей и с-fos мышей, а также у WT трудно объяснить, т.к. все операции по подготовке ДНК до стадии заполнения микропробирок для проведения ПЦР проводились для этих групп разными людьми и в разное время. Такой эффект могло дать загрязнение пробирки для ПЦР раствором из другой, причём какой-либо одной, т.к. 2-4 следы демонстрируют сильное сходство. Можно даже сказать, что это заражение произошло при добавлении в разлитые реакционные смеси образцов ДНК (возможно, носик пипетки не сменили, или при открывании образцов над реакционными пробирками, микрокапли упали в них сверху). Самые лёгкие полоски (самые верхние) можно объяснить слипанием праймеров в реакционной смеси. Об этом также говорит наличие большого числа лёгких продуктов в контрольной лунке (предпоследняя), хотя ДНК добавлено не было. Средние треки доказывают, что на этапе изготовления раствора реакционной смеси, до добавления ДНК, загрязнения не было – мы видим только продукт GFP.
Обсуждение.
Результаты поведенческого анализа явно говорят о том, что животные обучились замиранию. Однако, оба вида анализа флуоресценции не подтверждают этих результатов. Мы ожидали увидеть повышение уровня экспрессии zif268 в коре (на уровне интегральной оценки экспрессии) а также в конкретных структурах: гипокампе, цингулярной коре. Одобные результаты можно объяснить тем, что у zif-268 сравнительно высокий фоновый уровень экспрессии, и мы просто не смогли отделить фоновый уровень от индуцируемого обучением. Другим объяснение может быть сильное влияние того, что мыши уже перед обучением в модели условно-рефлекторного замирания получали «новизну» - перенос в рабочие, новые для них клетки, мечение маркерами. Кроме того, при резке с помощью вибротома обнаружились неисправности в работе, из-за чего срезы получались неравномерными по толщине, рваными, как бы слоистыми. Это сделало почти невозможным подсчёт клеток на срезах.
Выводы
В модели условно-рефлекторного замирания мыши демонстрируют способность с одного предъявления отрицательного подкрепления обучаться замиранию.
У zif-268 наблюдается высокий базальный уровень экспрессии, что затрудняет его использование как маркера обучения.
Для количественного анализа изменений в экспрессии zif268 в выбранной модели требуются дополнительные исследования.