Піросеквенування 2

Кількість випущених PPi :

ATФ сульфурілаза перетворює PPi до АТФ

АТФ використовується ферментом люціферази, щоб справити світло за допомогою люциферина

Кількість світла, що виникає прямо пропорційно кількості АТФ, яка є пропорційною до кількості випущених PPi.

Кількість випущених PPi вимірюється шляхом перетворення його в АТФ, за допомогою ферменту АТФ сульфурілази . ATФ потім використовується ферментом люціферази, щоб справити світло за допомогою люциферина. Кількість світла, що виникає в цій реакції прямо пропорційна кількості АТФ, яка, в свою чергу, прямо пропорційна сумі звільнених PPi, при додаванні нуклеотидів за допомогою полімерази.

Піросеквенування 3

Послідовне додавання кожного dNTP будує послідовність

Використовують фермент апірази, для денатурації dNTP після завершення реакції

Послідовність читається за допомогою кількості світла, що вимірюється так як кожен dNTP.

Послідовність визначається шляхом додавання кожного нуклеотиду, а потім визначається світло яке виробляється і скільки. Ця інформація реєструється на "пірограммі", від якої читається послідовність. Після додавання кожного нуклеотида і реакція завершається, фермент апірази додається для деградації нуклеотидів, що залишились.

Мембранне секвенування

Одиночні молекули ДНК проходять через пори мембрани

Кожний нуклеотид має дещо інший заряд

Заряд визначає як нуклеотиди проходять через мембрани

Існує багато проблем, при розроблені до цього методу, який може бути використаний для геномного секвенування.

Метод, який все ще перебуває в досить ранній стадії розвитку, включає в себе проходження окремих молекул ДНК через пори в ліпідних мембранах. Заряд кожного нуклеотида трохи відрізняється і може, бути виявлений яка молекула ДНК проходить через пори. Хоча основна концепція, здається, працює, існує багато проблем, пов'язаних з цією технологією, які повинні бути розв’язані перш ніж цей метод може бути використаний для великомасштабного геномного секвенування.

Висновки 1

Основи картування

• генетичне картування

--На основі частоти рекомбінації

- фізичне картування

-- перекриття ДНК фрагментів

-- можна використовувати рестрикцій ні ферменти

-- зондування з кінців фрагментів

-- комбінація: хромосомна ходьба (chromosome walking)

Таким чином, в цьому розділі ми обговорили, як генетичне картування використовує рекомбінаційні фрагменти, щоб визначити відносні відстані між генами на хромосомі і як фізичне картування знаходить перекриваючі фрагменти ДНК. Це завдання може бути зроблено за допомогою ферментів рестрикції, зондування кінців фрагмента, або поєднання цих двох методів у процесі, відомому як хромосоми ходьба.

Висновки 2

Основи секвенування

• метод зупинки ланцюга

• радіоактивні і флуоресцентні мітки

• розділення гелем або капілярним електрофорезом

• читання з рентгенівської плівки або лазерним детектором

Новітні технології

• оптичне картування

• піросеквенування

• мембранне секвенування

Ми також обговорили основи секвенування: метод зупинки ланцюга припиняє роботу і вимоги маркування продуктів реакції з радіоактивними або флуоресцентними мітками. Продукти реакції потім відділяють або через гель або капілярний електрофорез і читатають з рентгенівськї плівки або за допомогою лазера для виявлення флуоресцентно мічених продуктів. Ми також коротко обговорили оптичне картування, піросеквенування, і мембранне секвенування , які є нові технології, які могли б значно прискорити картування та секвенування.