2. Трансплантация эмбрионов

В некоторых лабораториях оперированные яйца трансплан­тируют псевдобеременным самкам 1-го дня вечером в день инъ­екции. Часто переносят 2-клеточные эмбрионы на следую­щее утро после операции. На это есть три причины. Первая заключается в том, что эмбрион должен опра­виться после микроинъекции прежде, чем будет подвергаться переносу. Вторая, и более существенная, связана с тем, что у значительного процента оперированных эмбрионов развитие блокируется на 1-клеточной стадии (10—20%) и нужно время, чтобы убедиться в отсутствии блока и целесообразности пере­носа. Блок развития на 1-клеточной стадии может происходить либо в результате свойств раствора ДНК, либо вследствие прямого физического повреждения яйца при микроинъекции. Третья причина состоит в том, что асин­хронный перенос больше соответствует замедленному развитию яиц, которое обусловлено оперативным вмешательством.

3. Скрининг трансгенного потомства

3.1. Аутопсия хвоста и прищипывание пальца

После переноса эмбрионов в яйцевод приемной матери не­обходимо время от времени наблюдать за течением беремен­ности, в частности, в середине срока взвесить реципиента. Если к вечеру 20-го дня не произойдет благополучных родов у явно беременной мыши, следует произвести кесарево сечение, так как число живых плодов может быть недостаточным для индук­ции естественной родовой деятельности.

Здоровое потомство отсаживается на 21-й день после рождения. В это время мышата достаточно велики для выявления инъецированных последовательностей ДНК путем биопсии хвоста для последующего анализа ДНК. Биопсия хвоста и нумерование животных прищипыванием паль­ца должны быть сделаны одновременно для экономии времени и во избежание возможных ошибок. Можно маркировать жи­вотных отверстиями в ушах, но этот метод следует оставить для кратковременных экспериментов.

3.2. Днк из плодов

В некоторых случаях анализ на трансгенность необходимо проводить на уровне плодов. Например, возможна ситуация, когда определенная генная конструкция, экспрессируясь во вре­мя эмбриогенеза, обусловливает пренатальную гибель. В этом случае анализ уже родившихся животных продемонстрирует низкую частоту трансгенных особей. Количество ДНК, достаточное для генотипирования индиви­дуальных плодов, может быть получено начиная с 8-го дня бе­ременности.

3.3. Анализ днк

Для первоначального анализа на трансгенность предложен ряд разнообразных методик. Обычно используют методом саузерн-блот , хотя дот-блот-гибридизация занимает меньше времени. Дополнительная информация, источником ко­торой служит первый из методов, в любом случае потребуется на более позднем этапе. ДНК хвоста следует обработать рестриктазой, высвобождающей внутренний фрагмент из интегриро­ванной конструкции ДНК, или ферментом, делающим в конст­рукции один разрез. Поскольку тандемное расположение превалирует, второй способ также даст фрагменты предсказуе­мого размера. Если бы трансген содержал последовательности, присутствующие также и в мышином геноме, можно было бы использовать зонд ДНК, гибридизующийся как с трансгеном, так и с собственным геном мыши при условии, что фрагменты, полученные в результате рестрикции, четко различаются. Это дает дополнительное преимущество при определении точного числа копий по силе гибридизационного сигнала.