2. Методы генной инженерии.

2.1. Эндонуклеазы рестрикции

Большинство методик в генной инженерии включают выделение определенных фрагментов ДНК и последующее их соединение с другими фрагментами для получения новых комбинаций генов. Для этих целей используются ферменты, которые специфически разрезают и вновь сшивают молекулы ДНК. Наиболее важной группой ферментов являются эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), катализирующие специфическое расщепление двунитевой ДНК, за открытие которых и разработку методов использования их в молекулярной генетике биохимики Вернер Арбер, Даниел Натанс и Хамилтон Смит были удостоены Нобелевской премии в1978 г.

Известно большое число рестриктаз. для их обозначения используются сокращенные названия микроорганизмов-продуцентов. В качестве примера рассмотрим ЕсоRi эндонуклеазу, выделенную из Еsсhегiсhiа соli.

Подобно многим другим рестриктазам, этот фермент расщепляет ДНК по палиндромной последовательности, т. е. короткому сегменту ДНК, в котором обе цепи при считывании в направлении 5’→З’ имеют одинаковую последовательность. для Есоli это последовательность 5’-ГААТТЦ-З’. ЕсоRi расщепляет фосфодиэфирные связи обеих цепей между Г и А.

Это приводит к образованию комплементарных «липких» концов (ААТТ), которые удерживаются вместе за счет водородных связей между комплиментарными основаниями. Их, однако, можно легко отделить друг от друга путем небольшого нагревания. При охлаждении липкие концы гибридизуются (т.е. соединяются как раньше за счет водородных связей) вновь в правильной ориентации. Места расщепления можно соединить с помощью ДНК-лигазы.

2.2. Клонирование днк

Обычно содержание в клетке какого-либо сегмента ДНК, например отдельного гена очень незначительно. Поэтому для проведения экспериментов с фрагментами ДНК их необходимо многократно копировать (клонировать). В классической методике клонирования ДНК используется способность клеток бактерий поглощать и реплицировать (репликация – катализируемый ферментами процесс удвоения ДНК) короткие кольцевые молекулы ДНК, известные как плазмиды. Сначала клонируемый фрагмент ДНК вырезается из исходной ДНК с помощью одной или двух рестриктаз. Вырезанный с помощью рестриктаз ген встраивают в плазмиду, которая называется вектором. В качестве вектора служит плазмида с единственным участком, узнаваемым ЕсоRi.

Кольцевая плазмида линеаризуется с помощью ЕсоRi и затем смешивается с изучаемым фрагментом ДНК. Поскольку фрагмент и вектор имеют одинаковые липкие концы, некоторые из молекул будут гибридизоваться таким образом, что клонируемый фрагмент окажется интегрирован в структуру вектора. Затем концы линейной молекулы ковалентно сшиваются с помощью ДНК-лигазы с образованим «рекомбинантной» плазмиды.

При обработке большого количества клеток некоторые из них поглощают рекомбинантную плазмиду (так называемая трансформация). Трансформированные клетки реплицируют плазмиду вместе с собственным геномом. Обычно используют плазмиды, придающие трансформированной клетке устойчивость (резистентность) к определенному антибиотику. При инкубации популяции клеток в присутствии антибиотика будут реплицироваться только те клоны, которые содержат плазмиду. Из полученного клона выделяют плазмиду и после расщепления рестриктазой ЕсоRi, получают множество копий клонированного фрагмента ДНК.