Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии в тонком слое целлюлозы

Принцип метода. На стеклянные пластинки наносят тонкий слой пористого носителя, например, целлюлозы. Пластинки помещают в растворитель (жидкая фаза), который, продвигаясь по слою за счет капиллярных сил, перемещает с различными скоростями компоненты смеси аминокислот. После проявления с помощью нингидриновой реакции на хроматограмме обнаруживаются пятна. Идентификацию положения аминокислот в смеси проводят, сравнивая положение пятен анализируемой смеси с положением пятен аминокислот-стандартов.

Принцип метода хроматографического разделения смеси амино­кислот в тонком слое аналогичен методу хроматографии на бумаге. Однако этот метод позволяет почти в 10 раз уменьшить концентрацию веществ, подвергающихся исследованию.

Материалы и реактивы. Целлюлоза, растворитель – смесь н-бутанола, уксусной кислоты, воды (4:1:1), смесь аминокислот и их стандартные растворы (0,1 %-ные растворы лизина, глицина и фенилаланина, приготовленные на 10 %-ном изопропиловом спирте, подкисленном соляной кислотой), свежеприготовленный нингид-риновый реактив (95 мл 0,5 %-ного раствора нингидринав 95 %-ном ацетоне, 1 мл ледяной уксусной кислоты и 4 мл дистиллированной воды).

Оборудование. Хроматографическая камера, стеклянные пластинки (13 X 18 см), пульверизатор, микропипетки, сушильный шкаф, карандаш, линейка, апликатор.

Ход работы. Тщательно вымытые и обезжиренные стеклянные пластинки покрывают с помощью апликатора суспензией целлюлозы в дистиллированной воде (3 г целлюлозы, 14 мл воды на 1 пластинку) и высушивают при комнатной температуре в течение 12 ч. На пластинку на расстоянии 2 см от ее нижнего края наносят по 20 мкл смеси аминокислот и их стандартные растворы. Пятна, возникающие на пластинке при нанесении исследуемых веществ, подсушивают для того, чтобы диаметр их находился в пределах 3- 4 мм.

Пластинку помещают в хроматографическую камеру, насыщенную парами растворителя, погружая нижний край пластинки в растворитель на 0,5-1 см. Хроматографию прекращают, когда фронт растворителя достигнет отмеченного уровня – не менее 10 см (примерно 1 ч хроматографирования).

После хроматографирования пластинку высушивают и проявляют, опрыскивая нингидриновым реактивом из пульверизатора и про­гревая в течение 10 мин при температуре 110 °С. Сравнивая положение пятен смеси аминокислот с положением пятен их стандартов, проводят идентификацию аминокислот. Определив с помощью линейки расстояние, пройденное растворителем и аминокислотами, рассчитывают коэффициент распределения R_f.

Разделение аминокислот методом ионообменной колоночной хроматографии

Принцип метода. В ионообменной хроматографии анализируемые смеси разделяют на полизарядных материалах, которые нерас­творимы в воде и содержат ионогенные группы. Метод разделения основан на различных значениях изоэлектрической точки (ИЭТ) разных аминокислот: основные аминокислоты (ИЭТ при рН ≥ 7), нейтральные (ИЭТ при рН 5,5—6,5) и кислые (ИЭТ при рН ≤ 5).

Материалы и реактивы. Ионообменная смола Дауэкс (1 X 10), 1 моль/л и 3 ммоль/л соляная кислота, 0,05 %-ный раствор уксус­ной кислоты, 0,2 %-ные растворы глутаминовой и асиарагиновой кислот, 1 %-ный раствор нингидрина в 95 %-ном ацетоне.

Оборудование. Стеклянные палочки, пипетки, пробирки, штатив для пробирок, капельницы, хроматографическая колонка (0,8 X X 0,8 см), фотоэлектроколориметр.

Ход работы. Хроматографическую колонку, заполненную ионообменной смолой Дауэкс (1 X 10), промывают 5 объемами 1 моль/л раствора соляной кислоты, а затем дистиллированной водой. В дальнейшем колонку промывают одним объемом (3 ммоль/л) раствора соляной кислоты (рН 3,0) и наносят 3 мл смеси растворов глутаминовой и аспарагиновой кислот (рН 3-4). Элюцию аминокислот начинают раствором уксусной кислоты. Первой элюируется глутаминовая кислота. Элюант контролируют по реакции с нингидрином, определяя экстинкцию на фотоэлектроколо риметре до тех пор, пока экстинкция раствора резко снизится, приближаясь к нулю. После выхода глутаминовой кислоты начинают элюирование аспарагиновой кислоты 1 моль/л раствором соляной кислоты. Элюант аспарагиновой кислоты контролируют также, как и глутаминовой кислоты.

По полученным значениям экстинкции строят кривые выхода глутаминовой и аспарагиновой кислот из колонки – по оси абсцисс откладывают значения экстинкции, а по оси ординат – номер проб.

Для определения количества аминокислот в разделяемой смеси необходимо построить калибровочные графики для каждой из аминокислот по стандартным их растворам. Хроматографирование смеси аминокислот и стандартов, а также определение экстинкции их раствора с нингадрином необходимо строго проводить в одних условиях. Суммируя значения, найденные во всех пробах, проверяют полноту снятия с колонки аминокислот-стандартов. Определив экстинкцию исследуемой аминокислоты из смеси, по калибровочным графикам находят ее количество.