2.1.3 Подсчет выросших колоний
Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1…15 суток инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.
Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30 до 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке.
Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:
где М – количество клеток в 1 мл;
а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;
V – объем суспензии, взятый для посева, мл;
10 – коэффициент разведения;
n – порядковый номер разведения, из которого сделан высев.
2.2 Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)
Метод используют для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах. В пробирки с жидкой средой вносят строго измеренный объем из различных разведений питательного субстрата. После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или отсутствовал рост, рассчитывают наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата. Таким образом, определение количества микроорганизмов методом предельных разведений включает приготовление разведений, посев в жидкую среду, регистрацию наличия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исходного субстрата.
2.2.1 Приготовление разведений
Разведения исходной суспензии готовят, как и для чашечного метода.
2.2.2 Посев и регистрация результатов
Стерильную среду предварительно разливают в пробирки (колбы)
и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого разведения или из 4…5 последних, причем каждое разведение высевают в 3…5 повторностях (параллельных пробирках). Количество посевного материала везде одинаково и, как правило, составляет 1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется от 2 до 15 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов, численность которых определяют. После инкубации регистрируют рост микроорганизмов, используя различные показатели: помутнение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде определенных продуктов метаболизма.
Наиболее вероятное число микроорганизмов в единице объема рассчитывают по таблице Мак – Креди (таблица 1), разработанной на основании методов вариационной статистики.
Таблица 1 – Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объема исходной суспензии (по Мак – Креди)
Число-вая характе- ристика |
Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок |
Чис-ловая характе- ристика
|
Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок |
||||||
2 |
3 |
4 |
5 |
2 |
3 |
4 |
5 |
||
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
000 |
0,0
|
0,0
|
0,0
|
0,0 |
130 |
― |
1,6 |
1,1 |
0,8 |
001 |
0,5 |
0,3 |
0,2 |
0,2 |
131 |
― |
― |
1,4 |
1,0 |
002 |
― |
― |
0,5 |
0,4 |
132 |
― |
― |
1,6 |
― |
003 |
― |
― |
0,7 |
― |
140 |
― |
― |
1,4 |
1,1 |
010 |
0,5 |
0,3 |
0,2 |
0,2 |
141 |
― |
― |
1,7 |
― |
011 |
0,9 |
0,6 |
0,5 |
0,4 |
200 |
2,5 |
0,9 |
0,6 |
0,5 |
012 |
― |
― |
0,7 |
0,6 |
201 |
5,0 |
1,4 |
0,9 |
0,7 |
013 |
― |
― |
0,9 |
― |
202 |
― |
2,0 |
1,2 |
0,9 |
020 |
0,9 |
0,6 |
0,5 |
0,4 |
203 |
― |
― |
1,6 |
1,2 |
021 |
― |
― |
0,7 |
0,6 |
210 |
6,0 |
1,5 |
0,9 |
0,7 |
022 |
― |
― |
0,9 |
― |
211 |
13,00 |
2,0 |
1,3 |
0,9 |
030
|
― |
― |
0,7 |
0,6 |
212 |
20,0 |
3,0 |
1,6 |
1,2 |
031 |
― |
― |
0,9 |
― |
213 |
― |
― |
2,0 |
― |
040 |
― |
― |
0,9 |
― |
220 |
25,0 |
2,0 |
1,3 |
0,9 |
041 |
― |
― |
1,2 |
― |
221 |
70,0 |
3,0 |
1,6 |
1,2 |
100 |
0,6 |
0,4 |
0,3 |
0,2 |
222 |
110,0 |
3,5 |
2,0 |
1,4 |
101 |
1,2 |
0,7 |
0,5 |
0,4 |
223 |
― |
4,0 |
― |
― |
102
|
―
|
1,1
|
0,8 0 |
0,6
|
230 |
― |
3,0 |
1,7 |
1,2 |
103 |
― |
― |
1,0 |
0,8 |
231 |
― |
3,5 |
2,0 |
1,4 |
110 |
1,3 |
0,7 |
0,5 |
0,4 |
232 |
― |
4,0 |
― |
― |
111 |
2,0 |
1,1 |
0,8 |
0,6 |
240 |
― |
― |
2,0 |
1,4 |
Продолжение таблицы 1
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
112 |
― |
― |
1,1 |
0,8 |
241 |
― |
― |
3,0 |
― |
113 |
― |
― |
1,3 |
― |
300 |
― |
2,5 |
1,1 |
0,8 |
120 |
2,0 |
1,1 |
0,8 |
0,6 |
301 |
― |
4,0 |
1,6 |
1,1 |
121 |
3,0 |
1,5 |
1,1 |
0,8 |
302 |
― |
6,5 |
2,0 |
1,4 |
122 |
― |
― |
1,3 |
1,1 |
303 |
― |
― |
2,5 |
― |
123 |
― |
― |
1,6 |
― |
310 |
― |
4,5 |
1,6 |
1,1 |
311 |
― |
7,5 |
2,0 |
1,4 |
430 |
― |
― |
11,5 |
2,5 |
312 |
― |
11,5 |
3,0 |
1,7 |
431 |
― |
― |
16,5 |
3,0 |
313 |
― |
16,0 |
3,5 |
2,0 |
432 |
― |
― |
20,0 |
4,0 |
320 |
― |
9,5 |
2,0 |
1,4 |
433 |
― |
― |
30,0 |
― |
321 |
― |
15,0 |
3,0 |
1,7 |
434 |
― |
― |
35,0 |
― |
322 |
― |
20,0 |
3,5 |
2,0 |
440 |
― |
― |
25,0 |
3,5 |
323 |
― |
30,0 |
― |
― |
441 |
― |
― |
40,0 |
4,0 |
330 |
― |
25,0 |
3,0 |
1,7 |
442 |
― |
― |
70,0 |
― |
331 |
― |
45,0
|
3,5
|
2,0
|
443 |
― |
― |
140,0 |
― |
332 |
― |
110,0 |
4,0 |
― |
444 |
― |
― |
160,0 |
― |
333 |
― |
140,0 |
5,0 |
― |
450 |
― |
― |
― |
4,0 |
340 |
― |
― |
3,5 |
2,0 |
451 |
― |
― |
― |
5,0 |
341 |
― |
― |
4,5 |
2,5 |
500 |
― |
― |
― |
2,5 |
350 |
― |
― |
― |
2,5 |
501 |
― |
― |
― |
3,0 |
400 |
― |
― |
2,5 |
1,3 |
502 |
― |
― |
― |
4,0 |
401 |
― |
― |
3,5 |
1,7 |
503 |
― |
― |
― |
6,0 |
402 |
― |
― |
5,0 |
2,0 |
504 |
― |
― |
― |
7,5 |
403 |
― |
― |
7,0 |
2,5 |
510 |
― |
― |
― |
3,5 |
410 |
― |
― |
3,5 |
1,7 |
511 |
― |
― |
― |
4,5 |
411 |
― |
― |
5,5 |
2,0 |
512 |
― |
― |
― |
6,0 |
412 |
― |
― |
8,0 |
2,5 |
513 |
― |
― |
― |
8,5 |
413 |
― |
― |
11,0 |
― |
520 |
― |
― |
― |
5,0 |
414 |
― |
― |
14,0 |
― |
521 |
― |
― |
― |
7,0 |
420 |
― |
― |
6,0 |
2,0 |
522 |
― |
― |
― |
9,5 |
421 |
― |
― |
9,5 |
2,5 |
523 |
― |
― |
― |
12,0 |
422 |
― |
― |
13,0 |
3,0 |
524 |
― |
― |
― |
15,0 |
Продолжение таблицы 1
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
423 |
― |
― |
17,0 |
― |
525 |
― |
― |
― |
17,5 |
424 |
― |
― |
20,0 |
― |
530 |
― |
― |
― |
8,0
|
531 |
― |
― |
11,0 |
|
544 |
― |
― |
― |
35,0 |
532 |
― |
― |
14,0 |
|
545 |
― |
― |
― |
45,0 |
533 |
― |
― |
17,5 |
|
550 |
― |
― |
― |
25,0 |
534 |
― |
― |
20,0 |
|
551 |
― |
― |
― |
35,0 |
535 |
― |
― |
25,0 |
|
552 |
― |
― |
― |
60,0 |
540 |
― |
― |
13,0 |
|
553 |
― |
― |
― |
90,0 |
541 |
― |
― |
17,0 |
|
554 |
― |
― |
― |
100,0 |
542 |
― |
― |
25,0 |
|
555 |
― |
― |
― |
180,0 |
543 |
― |
― |
30,0 |
|
― |
― |
― |
― |
― |
Для этого первоначально составляют числовую характеристику, которая включает три цифры. Первая цифра слева показывает число пробирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры обозначают число пробирок, в которых отмечен рост микроорганизмов при высеве из двух последующих разведений. Затем по таблице 1 находят наиболее вероятное число микроорганизмов, соответствующее данному значению числовой характеристики. Количество микроорганизмов в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.