1. 1:Вопрос:методы исследования клеток и тканей

2. 2:Строение и типы митотических хромосом

3. 3:Гиалиновый хрящ: строение и возрастные особенности

1.

Метод	Описание метода
Микроскопический	Гистологические и эмбриологические исследования неразрывно связаны и данным методом. Наиболее часто в этих исследованиях используется световой микроскоп. Кроме обычного светового микроскопа, в гистологии и эмбриологии используются микроскопы специального назначения:  фазово-контрастные;  интерференционные;  микроскопы с конденсором темного поля;  люминесцентные или флуоресцентные;  поляризационные. Фазово-контрастные и интерференционные микроскопы с конденсором темного поля служат для исследования неокрашенных клеток и тканей. Люминесцентные микроскопы используются для исследования естественной и искусственной люминесценции клеток и тканей.Поляризационные микроскопы предназначены для исследования ультраструктуры клеток, имеющих закономерные, регулярные структуры. Электронные и растровые используются для исследования ультраструктуры клеток. Стереосканные микроскопы дают объемное изображение объекта исследования.
Тотальный	Достаточно распространенный метод в гистологии, когда рассматриваются целые, нерасчлененные объекты, а сами препараты называются тотальными. К тотальным препаратам могут быть отнесены кровь, лимфа, половые клетки, зародыши ранних стадий развития, тонкие пленки тканей растений и животных.
Метод окрашивания	Для исследования большинства объектов в лучах проходящего света необходимо, чтобы они были тонкими, прозрачными и контрастными. Для того чтобы сделать объект тонким, его необходимо разрезать на тончайшие пластинки, которые называются гистологическими срезами. Чтобы объект сохранил по возможности прижизненное строение, его фиксируют, а для того, чтобы сделать его контрастным, используют данный метод.
Метод фиксированных и окрашенных постоянных препаратов	Данный метод является основным, или классическим. Для их изготовления объект исследования прогружают в фиксирующие жидкости, которые денатурируют белки и стабилизируют определенные структуры и соединения, подлежащие исследованию. Наиболее распространенным фиксатором является формалин. Он сшивает белки метиленовыми мостиками, вызывая их денатурацию. После фиксирования и промывания в воде объект исследования можно резать на тонкие пластинки, предварительно заморозив его на специальном замораживающем микротоме — приборе, при помощи которого изготовляют гистологические срезы. Для замораживания объекта чаще всего используют жидкий углекислый газ либо электрозамораживающую установку. Однако при таком методе обработки материала получают довольно толстые гистологические срезы. Для изготовления более тонких срезов, толщиной до 2 мкм, объект исследования необходимо пропитать веществом, которое сделало бы его более плотным. Такими веществами являются парафин, желатин и целлоидин. Объект после фиксирования и промывания погружают последовательно в спирты возрастающей концентрации — от 50 до 100 градусов для его обезвоживания и пропитывают желатиной, парафином или целлоидином. После пропитывания и уплотнения объекта его можно резать на микротоме. Гистологические срезы затем окрашивают специально подобранными красителями, большинство из которых избирательно окрашивает структурные компоненты клеток и тканей. Все красители можно разделить на три группы:  щелочные, или ядерные. Ими окрашивают ядра клеток и некоторые другие структуры, имеющие кислую реакцию, например эндоплазматическую сеть. Примером щелочных красителей могут быть гематоксилин, кармин, сафранин;  кислые, или цитоплазматические, которыми окрашивают цитоплазму клеток. Наиболее распространенными кислыми красителями являются эозин, пикриновая кислота, кислый фуксин, индигокармин;  специального назначения — избирательно окрашивают структурные компоненты клеток либо вещества определенной химической природы. Наиболее распространенными красителями специального назначения являются судан III, осмиеловая кислота, окрашивающая жиры и жироподобные вещества; орсеин, окрашивающий эластин. После окрашивания гистологические срезы быстро обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле или толуоле, переносят на предметное стекло, заливают тонким слоем канадского бальзами или полистирола и накрывают покровным стеклом. Бальзам, полистирол и стекло имеют одинаковый показатель преломления света, и лучи света минимально рассеиваются, проходя через препарат.
Метод прижизненного или витального окрашивания клеток и тканей	Экспериментальным животным в кровяное русло или в брюшную полость вводят красители, а затем исследуют их локализацию в клетках и тканях. Следовательно, при помощи этого метода исследуют структуры в живых клетках и изучают процессы их жизнедеятельности. Наиболее распространенными витальными красителями являются трипановый синий, нейтральный красный, нильский синий, которые употребляют в больших разведениях — 1 : 1000 и более.
Метод изготовления временных препаратов	Преимуществом временных препаратов перед постоянными является быстрота их изготовления и возможность наблюдать живые клетки и ткани. Временные препараты делают из мазков, соскобов, тонких пленок, расщепленных объектов или путем растягивания стенок полых органов. Объекты рассматривают в капле воды или физиологического раствора, либо в натуральном виде, либо подкрашивая их слабыми растворами витальных красителей.
Метод культуры тканей	Имеет большое значение при изучении процессов эмбрионального гистогенеза, регенерации и трансплантации тканей. Широко применяется в гистологии и эмбриологии. Суть данного метода в том, что отдельные клетки определенных тканей выделяют в стерильных условиях и культивируют в питательной среде, которая состоит из многих компонентов, необходимых для жизнедеятельности клеток. Клетки теплокровных животных культивируют в термостате при температуре тела, а холоднокровных — при комнатной температуре. Время от времени клетки пересевают на свежую питательную среду и используют на протяжении многих лет для экспериментов.
Метод микрохирургии	Используется для проведения экспериментов на клетках, тканях и зародышах в гистологии и эмбриологии. При помощи таких микроопераций можно, например, выделить из ткани отдельную клетку, удалить из клетки ядро, перенести ядро из одной клетки в другую или переместить часть клеток зародыша, разъединить бластомеры дробящегося яйца. Все эти эксперименты осуществляются при помощи прибора, который называется микроманипулятором. В состав этого прибора входят микроскоп, система рычагов с различной степенью плавного регулирования. К рычагам присоединяются миниатюрные инструменты: стеклянные капилляры, иглы, крючки.
Метод авторадиографии	Обнаруживаются вещества, меченные радиоактивными изотопами. Этот метод получил название гистохимического или цитохимического метода исследования.
Метод электронномикроскопического исследования	Изучение препаратов при помощи электронного микроскопа. В электронном микроскопе вместо пучка света используется пучок электронов, движущийся в вакууме, вместо оптических частей — магнитные поля, вместо глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку. Прямое увеличение электронных микроскопов достигает 600 тыс. раз.

2. ОБЩАЯ МОРФОЛОГИЯ МИТОТИЧЕСКИХ ХРОМОСОМ

Морфологию митотических хромосом лучше всего изучать в момент их наибольшей конденсации, в метафазе и в начале анафазы. Хромосомы животных и растений в этом состоянии представляют собой палочковидные структуры разной длины с довольно постоянной толщиной, у большей части хромосом удается легко найти зону первичной перетяжки, которая делит хромосому на два плеча. В области первичной перетяжки находится центромера, где расположен кинетохор; к нему подходят пучки микротрубочек митотического веретена, идущие в направлении к центриолям. Эти пучки микротрубочек принимают участие в движении хромосом к полюсам клетки при митозе. Некоторые хромосомы имеют вторичную перетяжку. Последняя обычно расположена вблизи дисталь-ного конца хромосомы и отделяет маленький участок, спутник. Вторичные перетяжки называют, кроме того, ядрышковыми организаторами, так как именно на этих участках хромосом в интерфазе происходит образование ядрышка. Здесь же локализована ДНК, ответственная за синтез рРНК. Плечи хромосом оканчиваются теломерами, конечными участками. Теломерные концы хромосом не способны соединяться с другими хромосомами или их фрагментами.

Размеры хромосом у разных организмов варьируют в широких пределах. Так, длина хромосом может колебаться от 0,2 до 50 мкм. Число хромосом у различных объектов также значительно колеблется, но характерно для каждого вида животных или растений. Совокупность числа, величины и морфологии хромосом называется кариотипом данного вида. Кариотип - это как бы лицо вида. Даже у близких видов хромосомные наборы отличаются друг от друга или по числу хромосом, или по величине хотя бы одной или нескольких хромосом, или по форме хромосом и по их структуре.

Около четверти века назад в практику хромосомного анализа стали широко входить методы дифференциального окрашивания хромосом. Впервые метод был предложен Касперссоном, который показал, что при обработке препаратов митотических хромосом с помощью флуорохрома акрихиниприта во флуоресцентном микроскопе видны поперечные светящиеся полосы (бэнды), расположение которых характерно для каждой хромосомы. Этот прием цитологического анализа в сочетании с генетическими наблюдениями уже в настоящее время позволил начать составление хромосомных карт человека, то есть находить места расположения генов на определенных участках хромосом (см. рис. 1). Молекулярные механизмы такой специфической окраски до сих пор еще не ясны, многие исследователи способность отдельных участков хромосом к окрашиванию связывают с их химическими различиями. Большое число наблюдений говорит о том, что избирательное окрашивание связано с локализацией так называемого гетерохроматина, ДНК которого обогащена А-Т парами оснований.

Каково же пространственное расположение отдельных деконденсированных интерфазных хромосом в трехмерном объеме клеточного ядра? Существует ли какой-либо порядок в размещении хромосом в интерфазном ядре или они хаотически разбросаны внутри него? Было обнаружено, что в объеме ядер хромосомы располагаются, повторяя ана-тело-фазную ориентацию. При этом каждое плечо хромосомы занимает определенную зону, объем которой не заходит в объем соседних хромосом, хотя они примыкают друг к другу. Каждая из хромосом в нескольких местах связана с ядерной оболочкой, как бы фиксируясь на ней. Фиксированы на ядерной оболочке и теломерные участки всех хромосом, которые располагаются на одном из полюсов интерфазного ядра. На противоположном полюсе ядра, также в связи с ядерной оболочкой, располагаются центромерные районы хромосом.

Суммируя общие представления о формах организации хромосом, можно прийти к заключению, что они могут находиться в двух альтернативных состояниях, в двух морфологических выражениях: 1) максимально конденсированное, компактное, метаболически неактивное транспортное состояние, предназначенное для того, чтобы в минимальном объеме без структурных нарушений перенести во время клеточного деления огромные по длине молекулы ДНК; 2) деконденсированное, при котором линейная длина развернутых хромосом увеличивается в десятки, а иногда и в сотни раз, метаболически активное состояние, связанное с синтезом ДНК и РНК (интерфаза).

3. Гиалиновая (стекловидная) хрящевая ткань окрашена в бледно-голубой цвет. Она образует суставные поверхности костей, вентральные части ребер, а также входит в состав трахеи и бронхов. Волокнистый компонент ее межклеточного вещества представлен одиночными волокнами коллагена (хондрина). Их диаметр составляет 660 нм и поэтому они не видны в световой микроскоп. Общее количество хондриновых волокон равно 18 % сухого веса ткани. Аморфное вещество содержит кислые и нейтральные гликозаминогликаны и кератосульфаты, количество их составляет около 20 % сухого веса ткани. Содержание воды в хрящевой ткани может достигать 80 %.

Хондроциты в гиалиновой хрящевой ткани окружены тонким оксифильным ободком, который называется капсулой. Она состоит из вновь сформированного межклеточного вещества, которое отличается низкой плотностью и сниженной концентрацией кислых гликозаминогликанов. Изогенная группа окружена широкой каймой базофильного вещества, образующего хондриновый шар. Хондриновые шары в целом обозначаются термином “территории”, тогда как менее базофильное межклеточное вещество между хондриновыми шарами называют “интертерриториальным пространством”. В полностью созревшей хрящевой ткани вокруг территорий появляется узкая оксифильная полоска.

Гиалиновая хрящевая ткань (textus cartilaginous hyalinus), называемая еще стекловидной (от греч. hyalos — стекло) — в связи с ее прозрачностью и голубовато-белым цветом, является наиболее распространенной разновидностью хрящевой ткани. Во взрослом организме гиалиновая ткань встречается на суставных поверхностях костей, в местах соединения ребер с грудиной, в гортани и воздухоносных путях. Большая часть встречающейся в организме у человека гиалиновой хрящевой ткани покрыта надхрящницей (perichondrium) и представляет собой вместе с пластинкой хрящевой ткани анатомические образования — хрящи. В надхрящнице выделяют два слоя: наружный, состоящий из волокнистой соединительной ткани с кровеносными сосудами; и внутренний, преимущественно клеточный, содержащий хондробласты и их предшественники — прехондробласты. Под надхрящницей в поверхностном слое хряща располагаются молодые хондроциты веретенообразной уплощенной формы. В более глубоких слоях хрящевые клетки приобретают овальную или округлую форму. В связи с тем что синтетические и секреторные процессы у этих клеток ослабляются, они после деления далеко не расходятся, а лежат компактно, образуя изогенные группы от 2 до 4 (реже до 6) хондроцитов. Более дифференцированные хрящевые клетки и изогенные группы, кроме оксифильного перицеллюлярного слоя, имеют базофильную зону межклеточного вещества. Эти свойства объясняются неравномерным распределением химических компонентов межклеточного вещества — белков и гликозаминогликанов. (Распределение белков и гликозаминогликанов межклеточного вещества неравномерное. Из-за этого в нем выделяют территориальный матрикс – непосредственно окружающий лакуны, а также межтерриториальный матрикс – весь остальной объем межклеточного вещества.) В гиалиновом хряще любой локализации принято различать территориальные участки межклеточного вещества, или матрикса. К территориальному участку относится матрикс, непосредственно окружающий хрящевые клетки или их группы. Здесь коллагеновые волокна II типа и фибриллы, извиваясь, окружают изогенные группы хрящевых клеток, предохраняя их от механического давления. В межтерриториальном матриксе коллагеновые волокна ориентированы в направлении вектора действия сил основных нагрузок. Пространство между коллагеновыми структурами заполнено протеогликанами. В структурной организации межклеточного вещества хряща большую роль играет хондронектин. Этот гликопротеин соединяет клетки между собой и с различными субстратами (коллагеном, гликозаминогликанами). Опорная биомеханическая функция хрящевых тканей при сжатии-растяжении обеспечивается не только строением ее волокнистого каркаса, но и наличием гидрофильных протеогликанов с высоким уровнем гидратации (65—85%). Высокая гидрофильность межклеточного вещества способствует диффузии питательных веществ, солей. Газы и многие метаболиты также свободно диффундируют через него. Однако крупные белковые молекулы, обладающие антигенными свойствами, не проходят. Этим объясняется успешная трансплантация участков хряща в клинике. Метаболизм хондроцитов преимущественно анаэробный, гликолитический. Структурной особенностью гиалинового хряща суставной поверхности является отсутствие надхрящницы на поверхности, обращенной в полость сустава. Суставной хрящ состоит из трех нечетко очерченных зон: поверхностной, промежуточной и базальной. В поверхностной зоне суставного хряща располагаются мелкие уплощенные малоспециализированные хондроциты, напоминающие по строению фиброциты. В промежуточной зоне клетки более крупные, округлой формы, метаболически активные. Глубокая (базальная) зона делится базофильной линией на некальцинирующийся и кальцинирующийся слои. В последний из подлежащей субхондральной кости проникают кровеносные сосуды и могут происходить процессы обызвествления хряща. Особенностью межклеточного вещества глубокой зоны суставного хряща является содержание в нем матриксных везикул — мембранных структур диаметром от 30 нм до 1 мкм, которые являются локусами инициальной минерализации скелетных тканей (помимо хряща, они обнаруживаются в костной ткани и предентине). Мембранные структуры образуются путем выбухания участка плазмолеммы хондроцита (соответственно остеобласта в костной ткани и одонтобласта в предентине) с последующим отпочковыванием от поверхности клетки и локализованным распределением в зонах минерализации. Они также могут являться продуктом полной дезинтеграции клеток. Питание суставного хряща лишь частично осуществляется из сосудов глубокой зоны, а в основном происходит за счет диффузии из синовиальной жидкости полости сустава.

Возрастные изменения и регенерация По мере старения организма в хрящевой ткани уменьшаются концентрация протеогликанов и связанная с ними гидрофильность ткани. Ослабляются процессы размножения хондробластов и молодых хондроцитов. В резорбции дистрофически измененных клеток и межклеточного вещества участвуют хондрокласты. Часть лакун после гибели хондроцитов заполняется аморфным веществом и коллагеновыми фибриллами. Местами в межклеточном веществе обнаруживаются отложения солей кальция («омеление хряща»), вследствие чего хрящ становится мутным, непрозрачным, приобретает твердость и ломкость. В результате появляющееся нарушение трофики центральных участков хряща может привести к врастанию в них кровеносных сосудов с последующим костеобразованием. Физиологическая регенерация хрящевой ткани осуществляется за счет малоспециализированных клеток надхрящницы и хряща путем размножения и дифференцировки прехондробластов и хондробластов. Однако этот процесс идет очень медленно. Посттравматическая регенерация хрящевой ткани внесуставной локализации осуществляется за счет надхрящницы. Восстановление может происходить за счет клеток окружающей соединительной ткани, не потерявших способности к метаплазии (т.е. превращения фибробластов в хондробласты). В суставном хряще в зависимости от глубины травмы регенерация происходит как за счет размножения клеток в изогенных группах (при неглубоком повреждении), так и за счет второго источника регенерации — камбиальных клеток субхондральной костной ткани (при глубоком повреждении хряща). В любом случае непосредственно в области травмы хрящевой ткани отмечаются дистрофические процессы, а далее располагаются пролиферирующие хондроциты. В течение первых 1—2 мес с момента травмы сначала образуется грануляционная ткань, состоящая из молодых фибробластов, постепенно замещающихся хрящеподобной (хондроидной) тканью, активно синтезирующей протеогликаны и коллаген II типа. Через 3—6 мес регенерат обретает сходство с гиалиново-фиброзным молодым хрящом.

Билет № 10