Метилирование днк у млекопитающих: общие сведения

У млекопитающих метилирование ДНК служит цели стабильного функционального подавления части генетического материала ( silencing ). У млекопитающих на протяжении всей жизни животного функционирует относительно малая доля генома (~5%), тогда как большую его часть составляет генетический балласт (Junk DNA). Последний подвергается интенсивному метилированию. Активация метилирования, кроме того, отмечена при различных процессах, приводящих к появлению новой ДНК: трансфекция ДНК, разного рода дупликации инициируют процесс модификации появившихся копий. Особой стимулирующей активностью в этом отношении обладают инвертированные повторы [ Selker, ea 1999 ]. Таким образом, повторяющиеся последовательности, с одной стороны, и присутствие 5- метил-цитозина, с другой, - характерные и взаимосвязанные признаки эукариотических геномов. Одни повторы, накапливавшиеся в геноме человека на протяжении эволюции, по-видимому, функционально бесполезны, другие (транспозоны) потенциально опасны. Естественно поэтому, что они сильно метилированы и, как следствие, неактивны, их транскрипция чревата для клетки метаболическим хаосом. Метилированные участки "ущемлены" и в другом отношении - они позже, чем активные последовательности, реп- лицируются в фазе S клеточного цикла [ Goldman, ea 1984 , Hatton, ea 1988 , Schmidt, ea 1990 ]. Что касается конкретного механизма блока транскрипции, индуцированного метилированием, то он опосредован изменением структуры хроматина (см. ниже).

Метилирование днк во время эмбриогенеза

Во время эмбриогенеза закономерно сменяют друг друга "волны" метилирования- деметилирования, в результате которых в конечном итоге устанавливается строго определенный рисунок метилирования конкретных генов и генома в целом. Он стабильно сохраняется в популяциях соматических клеток. Так, на стадии 1-2-клеточных делений происходит тотальное деметилирование генома, устраняющее профиль, сформированный в исходных половых клетках. Оно продолжается до стадии имплантации бластоциста [ Razin. ea 1995 ]. Относительно природы этого процесса существуют две точки зрения. Согласно гипотезе "активного деметилирования", остатки 5-метилцитозина удаляются из ДНК независимо от репликации благодаря активности обнаруженной в конце 90-х гг гликозилазы [ Jost, ea 1995 , Jost, ea 1993 , Jost. ea 1995 ] или ДНК-деметилазы [ Bhattacharya, ea 1999 ]. Последняя - весьма вероятный кандидат на роль агента, осуществляющего глобальное деметилирование генома. Противоположная точка зрения заключается в том, что деметилирование генома в эмбриональном развитии - процесс пассивный, который сводится к подавлению сопряженного с репликацией так называемого "поддерживающего" метилирования (maitenance methylation) [ Rougier, ea 1998 ]. После имплантации бластоциста начинается процесс охватывающего весь геном метилирования (метилирование de поvо, профиль которого в целом сохраняется в соматических клетках взрослого индивидуума.

Импринтинг: общебиологический аспект

При импринтинге специфический характер дифференциальной активности генов определяется полом организма, от которого эти гены унаследованы. У некоторых насекомых, например, грибных комариков (Sciaridae), весь набор отцовских хромосом элиминируется во время сперматогенеза. У этих организмов отцовские хромосомы маркируются в цитоплазме клеток зародышевой линии, удаляются при созревании гамет и не передают свои гены следующему поколению. У млекопитающих и высших цветковых растений отцовские и материнские гены оказывают разный эффект на развитие эмбриона, но в одинаковой степени представлены в гаметах, образующихся в результате мейоза. В этом случае вклады отцовского и материнского геномов в развитие организмов не эквивалентны и происходит видимое искажение менделевских правил наследования некоторых признаков.

Иными словами, характер экспрессии отцовского и материнского аллелей одного и того же гена в организме-потомке может быть различным, так как зависит от их происхождения. Молекулярные механизмы этого явления в настоящее время до конца непонятны. Предполагается, что в развитие феномена импринтинга вносят вклад зависимые от пола модификации ДНК определенных генов, в частности метилирование их регуляторных участков.

Импринтинг распространяется на узкую группу (более 20) генов млекопитающих, отличающихся от большинства генов тем, что их аллели функционально неравноценны. Обычно копии того или иного гена либо обе не работают, либо равно активны. В случае импринтированных генов активен только один аллель (отцовский или материнский), причем статус строго детерминирован именно происхождением (от какой из родительских клеток). Не все импринтированные гены идентифицированы в функциональном отношении: установлено, однако, что большинство из них обеспечивает развитие зародыша . Дифференциальная активность аллелей импринтированных генов обусловлена различиями в метилировании регуляторных последовательностей этих генов - энхансеров и сайленсеров , обладающих противоположными функциями ( рис. 1а ). Первые трансактивируют прилежащие гены, тогда как вторые, напротив, подавляют их активность. Результатом метилирования регуляторных последовательностей становится инвертирование их функций - энхансеры перестают активировать гены, а сайленсеры - их подавлять.

Мозаика метилированных и неметилированных (интактных) регуляторных последовательностей определяет импринтированное состояние гена. В клетках с мутантной ДНК-метилтрансферазой различия в профиле метилирования импринтированных генов сглаживаются и соответственно исчезают различия в их активности ( рис. 1б - http://humbio.ru/humbio/methilation/0000f345.htm

) [ Li, ea 1993 , Surani, ea 1993 ].

ХРОМОСОМА X: ИНАКТИВАЦИЯ

Хромосома X: инактивация, введение

Эпигенетическим факторам, влияющим на транскрипционную активность генома, придается большое значение. Одним из наиболее значимых эпигенетических факторов является процесс инактивации хромосомы X. Феномен инактивации хромосомы X описан давно ( Lyon, 1961 ), но он стал особенно актуальным в связи с изучением Х-сцепленных заболеваний , в числе которых одно из первых мест занимает синдром Ретта (RTT) ( Plenge et al., 2002 ).

У женщин в соматических клетках одна из двух Х-хромосом почти полностью инактивирована (за исключением псевдоаутосомного участка и нескольких дополнительных локусов). Инактивированная Х-хромосома реплицируется поздно, в конце фазы S, а в интерфазе она конденсирована и различима под микроскопом как половой хроматин, или тельце Барра.

Достигается инактивация посредством сложного многоэтапного процесса на той стадии, когда эмбрион состоит всего из нескольких клеток, - активируется локус Xisi , синтезируются большие количества соответствующей РНК, реорганизуется под ее воздействием структура хроматина и, наконец, метилируются многие (возможно, не все) входящие в ее состав гены. Этап метилирования придает инактивации стабильность в ряду клеточных поколений [ Razin. ea 1995 , Rigs, ea 1975 ]. Процесс в каждой отдельной клетке случаен - в одной клетке женского эмбриона инактивируется материнская хромосома X, тогда как в другой отцовская. Это приводит к своеобразному явлению мозаицизма женского организма , состоящего по сути из двух клонов, в клетках одного из которых работает материнская хромосома X, а в клетках другого - отцовская. Если в нормальном организме мозаицизм не виден, поскольку обе хромосомы Х интактны, то в случае присутствия в одной из них того или иного мутантного гена соответствующие патологические признаки имеют "гнездный" характер (проявляются только в тех клетках, в которых активирована содержащая мутантный ген хромосома). Наиболее демонстративна в этом отношении ангидротическая эктодермальная дисплазия , при которой мутантен ген хромосомы X, ответственный за развитие потовых желез . Отсутствие потовых желез на части кожных покровов имеет при этой патологии гнездный характер, что может быть наглядно продемонстрировано.

Как известно, женский кариотип характеризуется наличием двух хромосом X, а мужской - хромосомами X и Y. Этот факт свидетельствует о несоответствии содержания генетической информации у особей мужского и женского пола. У человека, как и у других млекопитающих, этот дисбаланс экспрессии генов двух хромосом X в женском кариотипе разрешается благодаря инактивации одной из хромосом X во всех клетках ( Heard, Avner, 1994 ; Gartler, Goldman, 2001 ).

Феномен инактивации хромосомы X впервые был описан М. Лайон в 1961 г ( Lyon, 1961 ) у мышей и в 1962г ( Lyon, 1962 ) у других млекопитающих (включая человека) и был охарактеризован, как транскрипционное "молчание" одной из хромосом X у млекопитающих женского пола, за счет которого достигается компенсация в организме продуктов, кодируемых генами хромосомы X. Подобное определение данного феномена остается актуальным и в настоящее время ( Plath et al., 2002 ).

Хотя отцовская хромосома X выборочно неактивна во внезародышевых тканях, в самом эмбрионе селективность процесса инактивации хромосомы X является произвольной. В результате у большинства женских особей наблюдается мозаичная экспрессия материнских и отцовских аллелей локусов хромосомы X. В среднем вклад каждой хромосомы 50%, но поскольку процесс Х-инактивации случайный, то этот вклад теоретически может существенно варьировать ( Belmont, 1996 ).

В отличие от активной, инактивированная хромосома X обладает следующими особенностями:

- полная транскрипционная инактивация ( Graves, Gartler, 1986 ), за исключением некоторых Х-сцепленных генов, неподверженных Х-инактивации, и гена XIST ( Disteche, 1995 );

- конденсация гетерохроматина в интерфазе ( Goto, Monk, 1998 );

- поздняя репликация в S фазе деления клетки ( Takagi, Oshimura 1973 );

- метилирование цитозина CpG динуклеотидов в 5'-положении в Х-сцепленных генах ( Monk, 1986 );

- 5) гипоацетилирование гистона Н4 ( Jeppesen, Turner, 1993 );

- 6) экспрессия гена XIST (X-inactive specific transcript) на инактивированной хромосоме ( Brown et al., 1991 ).

Фактически, селективность процесса Х-инактивации можно представить как случайный выбор инактивации одной из 2-х родительских хромосом X. Наблюдения X-инактивации при анеуплоидиях хромосомы X (т.е. 47,XXX ; 48,ХХХХ ; 48,XXYY ; 49,ХХХХХ ) показывают, что лишь одна из X хромосом всегда активна, тогда как остальные - неактивны. В клетках с тетраплоидным набором аутосом и четырьмя хромосомами X обнаруживают две активные и неактивные хромосомы X ( Goto, Monk, 1998 ).