Белки, взаимодействующие с мРнк, как регуляторы трансляции

Большинство регуляторных белков, взаимодействующих с 5'- концевыми TIR-последовательностями мРНК прокариот , являются негативными регуляторами трансляции. Пример регуляции экспрессии генов дают рибосомные белки E. coli - репрессоры собственного синтеза, которые предотвращают взаимодействие 30S субчастиц рибосом со своими мРНК. Оригинальный механизм репрессии использует рибосомный белок S15 , который, взаимодействуя с TIR-последовательностью своей мРНК, стабилизирует предсуществующий псевдоузел. В результате SD- область мРНК становится ловушкой для 30S субчастицы рибосом, которая взаимодействует с ней, но не может инициировать синтез белка.

Аналогичные механизмы функционируют и у эукариот. Хорошо изучена регуляция трансляции мРНК ферритина , синтазы дельта-аминолевулиновой кислоты и субъединицы b сукцинатдегидрогеназы позвоночных животных. 5'UTR мРНК этих белков содержат регуляторный элемент IRE (iron-responsive element) , с которым взаимодействует белок IRP (iron-regulatory protein) , акцептирующий ионы железа. В отсутствие железа IRP связывается с IRE и блокирует трансляцию мРНК. Сродство IRP к IRE понижается в 50-100 раз, если он находится в комплексе с ионами железа. Этого оказывается достаточно для вовлечения соответствующих мРНК в трансляцию.

eIF4E: УЧАСТИЕ В РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА БЕЛКА

Фактор eIF4E распознает кэп-структуры мРНК в составе многокомпонентного фактора инициации eIF4F , что является необходимым этапом объединения мРНК с 40S субчастицей рибосом .

Фактор eIF4E лимитирует инициацию трансляции. В большинстве клеток он присутствует в количестве 0,01-0,2 молекулы/рибосому, тогда как внутриклеточное содержание других факторов находится в пределах 0,5-3 молекулы/рибосому. Внутриклеточное содержание и активность фактора eIF4E регулируются на уровне транскрипции, посттрансляционно и путем взаимодействия с белками-репрессорами.

РНК антисмысловые как регуляторы трансляции

Прокариотические антисмысловые РНК длиной 70-110 нт образуют структуры типа "стебель-петля" , в которых стебель защищает эти РНК от деградации, а петля длиной шесть-восемь нт служит для первоначального взаимодействия с мРНК-мишенью. После образования комплексов РНК-РНК наблюдали изменение стабильности мРНК, эффективности процессинга РНК-мишени, терминации транскрипции или инициации их трансляции. Антисмысловые РНК являются мощными природными модуляторами экспрессии генов у прокариот. Данные о возможном участии природных антисмысловых РНК в регуляции трансляции у эукариот противоречивы.

Короткие ОРС как регуляторы трансляции

Около 10% мРНК растений содержат в своих 5'-концевых лидерных последовательностях более одного AUG-кодона . Некоторые из них удаляются с помощью альтернативного сплайсинга . Другие возникают в результате использования РНК-полимеразами альтернативных промоторов при инициации транскрипции соответствующих генов. Присутствие коротких ОРС в лидерных последовательностях мРНК, как правило, сопровождается снижением эффективности трансляции таких матриц. Функционирование этого механизма обнаружено в клетках млекопитающих, растений и дрожжей.

Влияние коротких ОРС на трансляцию расположенных ниже последовательностей нуклеотидов мРНК исследовано с использованием искусственных генно-инженерных конструкций, в которых изменяли длину и число потенциальных сайтов инициации трансляции, предшествовавших генам-репортерам. Оказалось, что ингибирующее действие коротких ОРС возрастает с увеличением их длины. Даже одиночный AUG-кодон снижает уровень трансляции ниже расположенных последовательностей в два раза. Короткие ОРС промежуточной длины (около 30 кодонов) обладали пятикратным ингибирующим действием, а протяженные ОРС (>100 кодонов) полностью подавляли трансляцию следующих за ними последовательностей. Механизм ингибирующего действия коротких ОРС связан с тем, что они транслируются, что снижает вероятность инициации трансляции на инициирующих кодонах, расположенных вслед за ними, поскольку процесс реинициации трансляции требует вхождения новых факторов инициации трансляции в инициаторный комплекс, включающий рибосому.

РЕГУЛЯЦИЯ ЭЛОНГАЦИИ СИНТЕЗА ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙ

Регуляция элонгации: скорость трансляции

Во время элонгации полипептидных цепей в процессе трансляции не все участки мРНК транслируются с одинаковой скоростью. Рибосомы в процессе трансляции мРНК могут задерживаться на кодонах, соответствующих минорным изоакцепторным тРНК, присутствующим в клетке. В этом случае внутриклеточная концентрация изоакцепторных тРНК лимитирует весь процесс трансляции.

Кодоны, соответствующие минорным изоакцепторным тРНК, А.С. Спирин предлагает называть модулирующими , поскольку они могут изменять скорость трансляции соответствующих мРНК. Чем больше модулирующих кодонов в мРНК, тем медленнее она транслируется. Клетка может изменять эффективность трансляции определенных мРНК путем адаптации внутриклеточных концентраций изоакцепторных тРНК к числу модулирующих кодонов этих мРНК. Показано, что во время интенсивного синтеза фиброина в шелкоотделительных железах тутового шелкопряда внутриклеточный спектр изоакцепторных тРНК сильно меняется и становится идеально соответствующим потребностям белоксинтезирующего аппарата клеток, осуществляющего трансляцию мРНК фиброина.

Другим фактором, от которого зависит изменение скорости перемещения рибосомы вдоль транслируемой молекулы мРНК, является пространственная структура матрицы. Для разворачивания индивидуальных участков пространственной структуры мРНК, обладающих неодинаковой стабильностью, требуется разное время, что отражается в различной скорости трансляции рибосомами индивидуальных мРНК.

Обнаружен ряд регуляторных белков, которые после взаимодействия с транслирующей рибосомой избирательно задерживают трансляцию в определенных местах мРНК. Например, у эукариот рибонуклеопротеидная частица, содержащая 7S-РНК, которая узнает особую N-концевую гидрофобную аминокислотную последовательность растущего полипептида, присоединяется к рибосомам и блокирует трансляцию до тех пор, пока рибосома не вступит во взаимодействие с мембраной эндоплазматического ретикулума.

Регуляция экспрессии генов на уровне элонгации трансляции широко распространена в природе. Во время многих вирусных инфекций скорость элонгации полипептидов зараженных клеток резко снижается. Это обнаружено у пикорнавирусов и вирусов осповакцины . Факторы элонгации трансляции могут быть мишенями различных регуляторных воздействий.

Регуляция элонгации: сдвиг рамок считывания

Процесс трансляции мРНК характеризуется высокой точностью, и даже систематические "ошибки" трансляции могут быть генетически запрограммированными. У бактерий транслирующая рибосома может пропускать протяженные последовательности нуклеотидов мРНК, не прекращая синтеза единой полипептидной цепи. Такое явление не известно у эукариот, однако в процессе декодирования кодона, находящегося в А-участке рибосомы , может происходить намеренное распознавание кодона "неправильной" аминоацил-тРНК или сдвиг рамки считывания у работающей рибосомы. Следствием этого бывает частичная супрессия терминации трансляции на терминирующих кодонах или синтез одной полипептидной цепи с использованием двух разных рамок считывания транслируемой РНК ( рис. I.40,е,ж ). Хорошо изучены такие явления у ретровирусов и ретротранспозонов , которые используют сдвиг рамки считывания и супрессию терминирующего кодона для экспрессии гена pol , в результате которой синтезируется гибридный белок, N-конец которого является частью полипептидной цепи белка оболочки вируса (продукта гена gag ). Тот же механизм используется и другими вирусами животных и клетками дрожжей.

Сигналом к сдвигу рамки считывания у ретровирусов и ретротранспозонов служат гептануклеотидная последовательность типа X.XXY.YYZ (размечена в виде кодонов в рамке считывания 0), а также ниже расположенный регуляторный элемент, образующий вторичную структуру в виде шпильки или псевдоузла. Сдвиг рамки происходит в момент, когда пептидил-тРНК, связанная с кодоном XXY в Р-участке рибосомы, и аминоацил-тРНК, взаимодействующая с кодоном YYZ в А-участке, одновременно сдвигаются на один нуклеотид назад и становятся напротив кодонов XXX и YYY транслируемой РНК. Сдвиг рамки считывания по этому механизму не всегда сопровождается образованием нового уникального белка, но часто приводит к синтезу небольшого числа вариантов полипептидных цепей, незначительно различающихся аминокислотными остатками в окрестностях сдвига рамки. Для осуществления сдвига рамки считывания РНК по такому механизму необходимо, чтобы обе молекулы тРНК в А- и Р-участках образовывали прочную связь с новыми кодонами, которые отличаются от первых только нуклеотидами в положении 3, допускающем неоднозначное соответствие антикодону.

Процесс сдвига рамки вызывается или усиливается структурным элементом РНК, перед которым работающая рибосома делает паузу в трансляции. Природа кодонов важна для функционирования механизма: из всех возможных XXY-кодонов в сайтах сдвига рамки считывания обнаружены только кодоны AAC, UUU, UUA и AAU. Терминирующие кодоны, часто обнаруживаемые сразу за сайтом сдвига рамки считывания, стимулируют сдвиг, так как вызывают остановку рибосомы. Эффективность сдвига рамки считывания составляет 1-30%.