Заместительная терапия гемофилии в

Первоначально терапия гемофилии В ограничивалась периодическими переливаниями плазмы крови, впоследствии замененными на более эффективные концентраты протромбинового комплекса – смеси витамин К-зависимых факторов свертывания крови IX, II, VII и X. Основным ограничением такой терапии был существенный риск развития тромботических эпизодов. Лекарственные препараты FIX с большей степенью чистоты были получены из фракций плазмы крови, разделяемой методом Кона, при помощи дополнительной очистки ионообменной хроматографией. Безопасность всех лекарственных препаратов FIX, получаемых из донорской плазмы, была существенно улучшена после внедрения процессов вирус-инактивации, включающих прогревание, обработку тиоцианатом натрия или детергентом и растворителем для удаления оболочечных вирусов, а также процесса нанофильтрации для удаления безоболочечных вирусов. Безопасность плазменных концентратов FIX также лимитируется существенным уровнем примеси активированного FIX (FIXa) и остаточных количеств других факторов свертывания, достаточных для увеличения риска возникновения тромботических эпизодов. Дополнительная очистка FIX при помощи иммуноаффинной хроматографии позволяет полностью удалить эти примеси, однако, как и в случае других продуктов переработки плазмы крови, риск вирусного или прионного инфицирования больных не может быть полностью устранен.

Рекомбинантный fix

В 1982 г. клонировали кДНК FIX, а вслед за этим в 1985 г. на основе клеток гепатомы крысы, фибробластов мыши и линии клеток почки хомячка (BHK) получили клеточные линии, секретирующие биологически активный FIX в культуральную среду. В 1986 г. была получена линия клеток CHO (яичник китайского хомячка), продуцирующая FIX и пригодная для промышленного культивирования.

В настоящий момент зарегистрирован один лекарственный препарат рекомбинантного FIX – нонаког альфа (торговое название Бенефикс), одобренный для применения в США и странах ЕС в 1997 г. Нонаког альфа получают в клетках CHO, культивируемых в питательной среде, не содержащей сыворотки или других продуктов животного происхождения. Выделение и очистку рекомбинантного FIX проводят при помощи четырех хроматографических стадий, не используя иммуноаффинную хроматографию, потенциально присутствующие вирусы удаляют при помощи нанофильтрации на фильтре с порогом отсечения 70 кДа. В готовой лекарственной форме нонакога альфа не используется альбумин человека. Таким образом, в процессе получения лекарственного препарата исключено использование веществ животного происхождения и компонентов донорской плазмы.

В ходе клинических испытаний рекомбинантного FIX было установлено, что безопасность и клиническая эффективность рекомбинантного и получаемого из плазмы крови вариантов FIX не имеют существенных различий. После проведения 1514 инфузий рекомбинантного FIX 56 больным не выявлено ни одного случая вирусной инфекции. Уровень иммунного ответа на вводимый препарат также был сходным у рекомбинантного FIX и получаемого из плазмы крови.

Различия в структуре рекомбинантного и природного FIX, а также функциональная значимость таких различий подробно изучены в ряде работ. Первоначально было установлено, что структура рекомбинантного и природного FIX весьма сходна. В то же время уровень восстановления активности FIX in vivo после инфузии рекомбинантного препарата был значительно ниже, чем при использовании природного FIX, что привело к увеличению рекомендуемой терапевтической дозы рекомбинантного FIX в 1.5–2 раза относительно природного. Детальное сравнение паттернов посттрансляционных модификаций в партиях рекомбинантного FIX, полученных на двух различных производственных площадках, не выявило никаких структурных различий. Таким образом, различия природного и рекомбинантного FIX не могут быть обусловлены особенностями производственных процессов.

FIX принадлежит к семейству витамин К-зависимых факторов свертывания крови, он состоит из четырех структурных доменов – Gla, двух ЭФР-подобных доменов и C -концевого домена сериновой протеазы. N-Концевой лидерный пептид FIX отделяется при транслокации полипептида в эндоплазматический ретикулум, пропептид, непосредственно предшествующий домену Gla, отделяется при секреции зрелого белка. Активационный пептид, расположенный между вторым ЭФР-подобным доменом и доменом сериновой протеазы, специфически отделяется факторами XIa или VIIa при активации FIX.

Наличие домена Gla, расположенного на N –конце молекулы зрелого FIX, является общим признаком для витамин К-зависимых белков. Этот домен обеспечивает связывание FIX и FIXa с поверхностью эндотелиальных клеток, причем такое взаимодействие полностью нарушается при блокировании γ-карбоксилирования остатков Asp в составе домена. Первый ЭФР-подобный домен FIX содержит высокоаффинный сайт связывания иона кальция, а также обуславливает взаимодействие FIX с фактором VIIIa и с тканевым фактором. В состав первого ЭФР-подобного домена входит редко встречающийся модифицированный остаток β-гидроксиаспартата (Hya), возникающий при β-гидроксилировании Asp64. Уровень данной посттрансляционной модификации не влияет на прокоагуляционную активность FIX, но замена Asp64 на остаток основной или нейтральной аминокислоты приводит к понижению активности FIX. Второй ЭФР-подобный домен FIX принимает участие в образовании комплекса FIXa–FVIIIa–FX. Он соединяется с доменом сериновой протеазы при помощи активационного пептида и единственной дисульфидной связи.

Активационный пептид FIX содержит большую часть сайтов посттрансляционных модификаций, влияющих на свойства FIX. Домен сериновой протеазы составляет около половины общей массы FIX, содержащийся в нем активный сайт скрыт активационным пептидом и экспонируется после его отделения. Домен сериновой протеазы не содержит известных посттрансляционных модификаций, после активации FIX он остается ковалентно связанным с N -концевой частью молекулы FIX при помощи одной дисульфидной связи, расположенной с обратной стороны домена (относительно области активного сайта). C-Конец FIXa также пространственно удален от активного сайта протеазы, что позволяет создавать слитные белки FIX и C -концевых белков-партнеров.

Из всех посттрансляционных модификаций только γ-карбоксилирование в домене Gla непосредственно определяет прокоагуляционную активность FIX. Влияние остальных модификаций на функции FIX выражено в меньшей степени, в ряде случаев оно отсутствует или остается неизвестным.

S P Gla EGF1 EGF2 AP Protease

Рис. 2. Структура FIX. S – сигнальный пептид, P – про-пептид, Gla – домен Gla, EGF1 и EGF2 – ЭФР-подобные домены, AP – активационный пептид, Protease – домен сериновой протеазы.