Экспериментальная часть
Предварительно перемешав исходную суспензию микроорганизмов, разлить её в лабораторные стаканчики, откуда отобрать по 3-5 мл в 4 пробирки.
Примечание: для подсчета исходного числа клеток использовать одну из пробирок (нулевая проба (х0)).
2. Каждой бригаде поместить 3 пробирки в 3 водяные термостатируемые бани с заданными температурами эксперимента (Т = 65 оC, 85 оС и 100 оС).
3. Через определенные промежутки времени (15 минут) отбирать из пробирок пробы микробных суспензий для подсчета числа клеток.
4. Произвести подсчет общего числа клеток в отобранных пробах с использованием счетных камер Горяева-Тома, а также числа живых клеток с предварительным окрашиванием проб микробных суспензий.
Подсчет клеток в счетных камерах
Этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов – дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева-Тома (рис. 1.2), хотя можно применять и другие.
Эта камера представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть стекла нанесена сетка. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 1/25 мм2 (большой квадрат) или 1/400 мм2 (малый квадрат). Часть предметного стекла, на 0,1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры, она всегда указывается на предметном стекле.
а
h
в
б
а – вид сверху; б – вид сбоку;
в – вид сетки камеры при малом увеличении микроскопа
Рис. 1.2 – Камера Горяева-Тома
При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящихся в камере, соответствует расчетному. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой.
Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3-5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в водной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием в 0,5 % -ном водном растворе формалина. Число клеток подсчитывают с объективом 8× или 40×. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую сторону квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600.
Точность определения зависит от того, насколько плотно пришлифовано покровное стекло к поверхности камеры, поэтому подсчет клеток повторяют 3-4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой суспензией микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:
,
где х – число клеток в 1 мл суспензии;
а – среднее число клеток в квадрате сетки;
h – глубина камеры в мм;
S – площадь квадрата сетки в мм2;
103 – коэффициент перевода см3 в мм3;
n – разведение исследуемой суспензии.
Сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, из которых 25 разделены на 16 малых квадратов, 100 – на прямоугольники и 100 остаются чистыми.
Каждая их 15 вертикальных и горизонтальных полос сетки Горяева имеет ширину, равную 1/5 мм, причем каждая третья полоса разделена в свою очередь на 4 узкие полоски шириной 1/20 мм, при пересечении которых образуются маленькие квадратики площадью 1/400 мм2. Они составляют 25 групп из 16 квадратиков. Для подсчета используются большие квадраты, разделенные на 16 маленьких.