6. Лабораторна робота №4 Складні методи забарвлення. Забарвлення бактерій по Граму

Мета роботи: Ознайомлення з методикою забарвлення бактерій по Граму.

Теоретичні основи: Складні або диференційовані способи забарвлення бактерій за­сновані на особливостях фізико-хімічної будови мікробної клітини. Ці способи забарвлення використовуються для вивчення клітинних структур, а також для характеристики та ідентифікації мікроорганізмів.

На відміну від простих методів забарвлення при користуванні складними методами використовуються декілька барвників. До складних методів забарвлення відносять забарвлення по Граму, Цилю-Нільсену, Нейссеру, Романовському-Гімзе.

Найбільш універсальним з усіх складних методів забарвлення є метод забарв­лення по Граму. Він має важливе діагностичне значення при визначенні видів бактерій. Усі бактерії за цим методом поділяються на дві групи: грам позитивні (Г⁺) та грамнегативні (Г^-). Складність методу полягає в тому, що одні клітини утворюють міцний, не розчинний у спирті, комплекс барвника генцианвіолета з йодом або іншого барвника трифенілметанового ряду (кристалічний фіолетовий, метиленовий фіолетовий). Ці мікроорганізми забарвлюються барвником у фіолетовий колір та належать до грампозитивних організмів. Клітини інших мікроорганізмів після обробки генцианвіолетом та йодом знебарвлюються спиртом та забарвлюються у рожевий колір при додатковому забарвленні фуксином. Такі мікроорганізми складають групу грамнегативннх бактерій.

Основну роль у забарвленні грає клітинна стінка, будова якої у Г⁺ та Г^- мікроорганізмів має принципові відмінності. У Г⁺ бактерій муреїновий каркас багатошаровий та складає до 90% усієї маси стінки. При обробці клітин спиртом відбувається розбухання пептидоглікану та зменшення діаметра пор клітинної стінки, що приводить до зни­ження її проникної здатності, у тому числі і для барвника.

У Г^- бактерій пептидоглікан одношаровий, рідше двошаровий. Зовнішня мембрана клітинної стінки Г^- мікроорганізмів також не є значним бар'єром на шляху проходження барвника, бо при обробці спиртом відбувається розчинення та вимивання ліпідів, що значним чином збільшує проникність клітинної стінки.

Здатність клітин забарвлюватися по Граму залежить від ряду причин та, насамперед, залежить від віку культури. Для забарвлення по Граму доцільно брати молоді, 8 - 24 годинні, клітини, бо при старінні культури у популяції збільшується кількість мертвих клітин, які завжди забарвлюються грамнегативно.

Матеріали, реактиви й устаткування:

Предметні скельця, бактеріологічні петлі, пробірки зі стериль­ною водопровідною водою, сірники, сухе пальне, фільтрувальний папір, імерсійна олія, мікроскопи, розчин кислого фуксину, генциан-віолет, метиленовий синій, 96% етиловий спирт, розчин люголю, добові культури мікроорганізмів.

Хід роботи:

Забарвити по Граму суміш клітин Г⁺ та Г^- мікроорганізмів.

Забарвлення по Граму проводится таким чином:

1. Па фіксований мазок наносять краплю генциан-віолету або метиленового синього. Забарвлення проводиться протягом 1 - 2 хвилин.

2. Зливаємо барвник та, не промиваючи мазок водою, наносимо розчин люголя на одну хвилину (до почорніння препарату).

3. Зливають розчин люголя та промивають мазок спиртом на протязі 30-50 секунд, постійно похитуючи предметне скельце.

4. Препарат промивають водою.

5. Далі на мазок наносять фуксин та забарвлення проводять на протязі 1-2 хвилин.

6. Зливши розчин фуксину, препарат промивають водою, висушують фільтрувальним папером та мікроскопують. При правильному за­барвленні грампозитивні бактерії забарвлюються генцианвіолетом в синьо-фіолетовий колір, грамнегативні - в додатковий червоний колір фуксином.

Контрольні питання:

1. За яким принципом бактерії поділяються на грампозитивні та грамнегативні?

2. Методика забарвлення бактерій по Граму.

3. В чому полягає різниця між простим та складним методами забарвлення?

4. Чому грампозитивні бактерії забарвлюються в синій колір, а грамнегативні – в рожевий?

Форма звітного бланка до лабораторної роботи №4.

Група	Курс	Лабораторна робота №4
		Складні методи забарвлення. Забарвлення бактерій по Граму
Прізвище студента
1) Рисунок суміші мікроорганізмів …………………………………… (назва препарату мікроорганізмів латинською) 2) Заповніть таблицю Забарвлення клітин при внесенні барвників та реактивів Внесений барвник, реактив Колір клітин Г+ Г- Генциан-віолет (метиленовий синій) Розчин люголю Спирт 96% Фуксин 2) Відповідь на контрольні питання 3) Висновки по лабораторній роботі №4
Роботу прийняв			Дата		Підпис