Информационно-дидактический блок

Микрометод. В настоящее время метод серийных разведений при определении антибиотикочувствительности и антимикробной активности модифицирован в микрометод с применением 96-луночных планшетов для иммунологических исследований. Концентрацию рабочих растворов антибиотиков, вносимых в лунки планшета, рассчитывают исходя из схемы последующей инокуляции, которая должна основываться на необходимости задания 5×10⁵ КОЕ/мл (КОЕ – колониеобразующая единица).

На практике применяют два варианта микрометода.

В первом варианте концентрация антибиотика в рабочем растворе, приготовленном на жидкой питательной среде, равна заданной. В этом случае объем инокулята должен составлять не более 10% от объема в лунке. Так, если рекомендованный объем раствора антибиотика в лунке будет составлять 0,1 мл, объем инокулята – 0,01 мл, то его концентрация - 5×10⁵ КОЕ/мл.

Во втором варианте концентрация антибиотика в рабочем растворе должна быть в 2 раза больше, чем заданная. Рекомендуемый объем раствора антибиотика – 0,05 мл, объем инокулята – также 0,05 мл, с его концентрация – 10⁶ КОЕ/мл, т.е. 5×10⁵ КОЕ/мл ×2.

После внесения рабочих растворов антибиотиков в лунки запаянные в полиэтилен планшеты могут хранится при температуре ниже 60 ºС до момента использования. Повторное замораживание и оттаивание недопустимо.

Для проведения исследований планшеты после извлечения выдерживают до достижения ими комнатной температуры. Доведенную до заданной концентрации по стандарту мутности культуру инокулируют не позднее чем через 15 мин после приготовления и инкубируют 16-20 ч при 37 ºС. Учет результатов осуществляют как при макрометоде – визуально, по появлению видимой мутности, либо спектрофотометрически. За МПК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.

Несмотря на сходство методических подходов, как определение чувствительности (устойчивости) микроорганизмов, так и определение концентрации антибиотика имеют свою специфику. Именно поэтому необходимо различать применение методов серийных разведений и диффузии в агар для определения чувствительности (устойчивости) микроорганизмов от таковых для определения активности (концентрации) антибиотиков.

Наряду со стандартными методами существуют также и специальные методы для определения концентрации антибиотиков (физико-химические, радиоиммунологические, ферментные и др.), которые являются более точными и занимают меньше времени, однако для их проведения требуется специальное оборудование и реагенты. В то же время при создании новых антибиотиков или усовершенствовании технологии на стадии «отработки» биотехнологического процесса необходимо контролировать содержание антибиотика одновременно как стандартными, так и специальными методами. Это позволяет определить потери на стадии выделения и очистки. Например, при промышленном получении антибиотиков химические методы контроля культуральной жидкости требуют предобработки образца (экстракция, отделение примесей), что влечет за собой потерю антибиотика.