Развернутая ра для выявления антител в исследуемой сыворотке крови
Для постановки реакции необходимо иметь:
1) исследуемую сыворотку крови;
2) 0,85% раствор NaCI (физиологический раствор);
3) антигенный диагностикум, т.е. взвесь микроба определенной концентрации.
Вначале готовят разведение сыворотки больного. В отдельную пробирку добавляют 2,4 мл физиологического раствора и 0,1 мл сыворотки - получается разведение сыворотки 1:25, это основа для последующего приготовления ряда последовательных двукратных разведений. В штатив устанавливают 7 пробирок, 2 последние из них - контрольные. Во все пробирки, кроме последней (контроль сыворотки), наливают по 0,5 мл физиологического раствора. Затем из пробирки (основное разведение сыворотки 1:25) берут 0,5 мл и добавляют в первую пробирку - здесь получилось разведение 1:50. Из 1-й пробирки вновь берут 0,5 мл и переносят во 2-го - здесь разведение сыворотки составляет уже 1:100. Таким же образом готовят ряд последовательных двукратных разведении сыворотки. Из 5-й пробирки 0,5 мл жидкости выливают в сосуд с дезинфицирующим раствором. В 6-й пробирке - только физиологический раствор (контроль антигена), в 7-ю добавляют 0,5 мл основного разведения сыворотки (1:25).
На следующем этапе работы во все пробирки, кроме 7-й (контроль сыворотки), вносят по 2-3 капли антигенного диагностикума, т.е. живой микробной взвеси, содержащей 3-4 млрд. микробных тел в 1 мл. Жидкость во всех пробирках мутнеет. Штатив с пробирками встряхивают и помещают на 2 ч в термостат. Через 2 ч учитывают предварительный результат реакции (агглютинация с Н-антигеном).
Окончательный результат учитывают через 16-18 ч при нахождении пробирок в условиях комнатной температуры (агглютинация с О-антигеном). При положительной реакции на дне пробирки образуется агглютинат - осадок в виде перевернутого зонтика, надосадочная жидкость остается прозрачной (рис.6). При встряхивании пробирки наблюдаются так называемые "смерчи", которые быстро распадаются на крупные хлопья. Отрицательная реакция - содержимое пробирки равномерно мутное, отсутствует осадок. Жидкость такая же, как и в 6-й пробирке (контроль антигена). В 7-й пробирке (контроль сыворотки) жидкость прозрачна, но нет осадка (табл.7).
Таблица 7 Постановка развернутой реакции агглютинации |
||||||||||||||
Ингредиенты |
Опытные пробирки |
Контрольные пробирки |
||||||||||||
1-я |
2-я |
3-я |
4-я |
3-я |
Контрольные антигены |
Контроль сыворотки |
||||||||
Изотонический раствор NaCl (0,85%), мл |
0.5 |
0,5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
- |
|||||||
Исследуемая сыворотка в разведении 1:25. мл |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
- |
0,5 |
|||||||
Полученное разведение сыворотки |
1:50 |
1:100 |
1:200 |
1:400 |
1:800 |
|
|
|||||||
Диагностикум (4 .млрд. микробных тел в 1 мл), капли |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
3 |
- |
|||||||
Инкубация при 37°С в термостате 2 ч с последующим выдерживанием при комнатной температуре (16-22°С) до следующего дня. |
||||||||||||||
Результаты |
+++ |
+++ |
- |
- |
- |
- |
- |
|||||||
Титр сыворотки 1:100 |
||||||||||||||
За титр сыворотки принимают последнее разведение сыворотки, в которой еще наблюдается четкая агглютинация. Интенсивность РА оценивают по 4-х крестовой системе. Положительной считается как минимум 3-х крестовая реакция.
