Работа 2. Оценка жизнеспособности клеток и степени агрегированности суспензии

Материалы и оборудование: колбочка с суспензией, сте­рильная пипетка с отрезанным концом, резиновая груша, пенициллиновый пузырек, краситель — 0,1%-я синяя Эванса или метиленовая синяя, предметное стекло, стеклянная палочка, камера для подсчета элементов крови, микроскоп.

Объяснение. Суспензия состоит из одиночных клеток и агрегатов, которые вместе называются культивируемыми еди­ницами. Для определения жизнеспособности клеток и агрега­тов применяют прижизненную окраску суспензии. Живые клетки не окрашиваются, в них видно движение цитоплазмы. В мертвые клетки краска проникает, они окрашиваются в темно-синий цвет. Существует следующее правило: если по­ловина (50%) или большее количество клеток в агрегате не окрашивается, он считается живым. Степень агрегированности суспензии устанавливают под микроскопом. Обычно подсчет ведут так: смотрят одиночные клетки, агрегаты от 2 до 5, от 6 до 20, от 21 до 50 клеток. Анализируют не менее 1000 куль­тивируемых единиц.

Ход работы. Для подсчета жизнеспособных клеток на предметное стекло нанести каплю суспензии, рядом — каплю краски. Смешать стеклянной палочкой. Сосчитать под микро­скопом не менее 1000 культивируемых единиц. Вычислить процент жизнеспособных клеток. Результаты записать. Для определения степени агрегированностн суспензии на предмет­ное стекло нанести каплю суспензии. Подсчет вести, как опи­сано в объяснении, результаты записать в виде таблицы.

Работа 3. Подсчет плотности клеток в суспензионной культуре

Материал и оборудование: колбочка с суспензией, сте­рильная пипетка с отрезанным копчиком, резиновая груша, пенициллиновый пузырек, 20% хромовая кислота, пипет­ка с оттянутым носиком, камера Фукса-Розенталя (гемоцитометр), камера для подсчета элементов крови, микроскоп, покровные стекла.

Объяснение. Одним из основных показателей, характери­зующих состояние клеточной системы в суспензии, является плотность клеточной популяции. Число клеток определяют в счетной камере под микроскопом после мацерации (разде­ление клеток) суспензии. В качестве мацерирующего веще­ства применяется 10—20% хромовая кислота, которая гидролизует срединные пластинки, соединяющие клетки. Смесь ставят в термостат при температуре 60°C на 10—30 мин в зависимости от особенности суспензии (агрегированности, химического состава клеточных стенок и т. д.). Непосредст­венно перед подсчетом для лучшего разделения клеток ее не­сколько раз пропускают через шприц с толстой иглой (пипетирование).

Хорошо растущая суспензия имеет S-образную кривую роста. Различают три фазы ростового цикла суспензии: лаг-фаза (2 - 3 сут), фаза экспоненциального роста (2 – 10 сут) и стационарная фаза (10 - 15 сут). Продолжительность фаз зависит от вида растения и органа, из которого получена культура каллуса и затем суспензия, от начального количества клеток (первичного инокулята), от условий выращивания. Обычно длительность пассажа (время до пересадки) состав­ляет 14—16 дней. При этом плотность возрастает от 5х10⁴–10⁵ до 5х10⁶ кл/мл. Для субкультивирования (пересадки) суспензия берется в конце экспоненциальной фазы. Для каж­дой культуры надо подбирать условия, при которых рост сус­пензии оптимален: реализуется S-образная кривая при высо­кой (70—80%) жизнеспособности.

Ход работы. Отобрать пипеткой со срезанным кончиком несколько миллилитров суспензии, предварительно взболтав ее в колбе. Для предварительного подсчета можно пользоваться суспензией из 1 колбочки, а для построения ростовой кривой нужно 3 повторности, т. е. суспензия из 3 колбочек (например, по 2 мл из каждой) сливается в одну емкость. К 1 объему исследуемой суспензии добавить 2 объема хро­мовой кислоты. Поставить в термостат при 60° на 10 мин. За­тем пропустить смесь через шприц с большой иглой 3 раза. Все операции проводят с большой осторожностью, так как хромовая кислота оставляет пятна на руках, одежде и рабо­чих поверхностях.

Камеру Фукса-Розенталя и покровное стекло тщательно промыть, высушить. Притереть покровное стекло к камере до появления колец Ньютона. Пипеткой с узким носиком на­брать мацерируемый раствор и поднести к краю покровного стекла, при этом жидкость заполняет весь объем камеры. Клетки считают под микроскопом, в 4 больших квадратах по диагонали или во всей камере. При каждом заполнении сус­пензией считать клетки в верхней и нижней сетках. Подсчет повторить 3 - 4 раза (обычно 1000 клеток) для получения достоверных данных.

Для построения S-образной кривой роста показатели снимаются через день в процессе всего культивирования. Плот­ность суспензии определяют по формуле

x

3,2

= ──────── ,

где x —число клеток, мл;

m — среднее из 6 - 8 повторностей число клеток в камере;

n — разведение.