4.3 Генная инженерия

За последние 10—15 лет были созданы принципиально новые методы манипулирования с нуклеиновыми кисло­тами in vitro, на основе которых зародился и бурно разви­вается новый раздел молекулярной биологии и генетики — генная инженерия. Принципиальное отличие генной инже­нерии от использовавшихся ранее традиционных приемов изменения генотипа (например, создания полиплоидных форм растений) состоит в том, что она дает возможность конструировать функционально активные генетические структуры in vitro в форме рекомбинантных ДНК. Понятия «генная» и «генетическая» инженерия ча­сто употребляют как синонимы, хотя последнее является более широким и включает манипулирование не только отдельными генами, но и с более крупными частями генома. Работа по переделке генотипа животных или ра­стений с помощью скрещиваний ограничены пределами вида либо близких в видовом отношении форм. Напротив, генная инженерия, как будет показано ниже, стирает межвидовые барьеры, обеспечивая возможность создания организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. Генная, инженерия представляет собой совокупность методов, позволяющих не только получать рекомбинантные ДНК из фрагментов геномов разных организмов, но и вводить такие рекомбинантные молекулы в клетку, создавая усло­вия для экспрессии в ней введенных, часто совершенно чужеродных генов. Таким образом, в этом случае иссле­дователь оперирует непосредственно с генами, причем их перенос может не зависеть от таксономического родства используемых организмов. Эта особенность генной инже­нерии представляет ее главное отличие от ранее исполь­зовавшихся приемов изменения генотипа (Алиханян, 1985).

Первенствующую роль в формировании генной инжене­рии сыграла генетика микроорганизмов, идеи и методы, разработанные молекулярной генетикой и химией нуклеи­новых кислот. Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 г., когда группа П. Берга в США соз­дала первую рекомбинантную ДНК in vitro, объединившую в своем составе генетический Материал из трех источни­ков: полный геном онкогенного вируса обезьян SV40, часть генома умеренного бактериофага и гены галактозного оперона Е.coli. Сконструированная рекомбинантная моле­кула не была исследована на функциональную активность, поскольку у авторов этой работы возникли опасения, что методы генной инженерии могут привести к появлению микроорганизмов, опасных для здоровья человека, напри­мер бактерий Е.coli, способных перенести онкогенные вирусы животных в кишечник человека. Разработанные позднее правила работы с рекомбинантными молекулами позволили практически устранить возможность вредных последствий создания рекомбинантных ДНК, объединяю­щих в своем составе гены разного происхождения.

Функционально активные молекулы гибридной ДНК были впервые получены С. Козном, Д. Хелинским, Г. Бойером и их сотрудниками (1973—1974). Группа Коэна последовательно решала проблему объединения и моле­кулярного клонирования (избирательного накопления) молекул ДНК, выделяемых из организмов, все более уда­ленных друг от друга в филогенетическом отношении. Процедура клонирования заключалась в том, что ДНК из разных источников фрагментировали путем обработки эндонуклеазой рестрикции, затем эти фраг­менты объединяли in vitro с векторной молекулой ДНК, способной к автономной репликации (например, плазмидой), и вводили путем трансформации в реципиентный организм, которым служила Е.coli, для накопления реком-бинантных ДНК. Использование плазмиды в качестве век­тора обеспечило возможность переноса и стабильного на­следования клонированного фрагментам составе гибрид­ной молекулы в клетках-реципиентах. Таким путем были созданы первые «химерные» (т. е. не способные возник­нуть в природных условиях) плазмиды, включившие в свой состав ДНК из разных видов бактерий, а затем и из выс­ших организмов, например участок ДНК из ооцитов шпорцевой лягушки (Xenopus laevis), кодирующий синтез рРНК; фрагмент ДНК морского ежа, контролирующий синтез белков-гистонов; фрагмент ДНК митохондрий мыши. Путем трансформации химерные плазмиды вво­дили в клетки Е.coli, где удалось зарегистрировать тран­скрипцию ДНК высших организмов. Вскоре функцио­нально активные рекомбинантные ДНК были сконструированы в СССР С.И. Алиханяном и А. А. Баевым с сотруд­никами (Алиханян, 1985).

Выполнение любой генно-инженерной программы вклю­чает необходимость получения фрагментов ДНК, несущих нужный ген, объединение их in vitro с век-торными моле­кулами, способными обеспечить доставку гена в организм реципиента, создание условий для стабильного наследова­ния и эффективной экспрессии перенесенного гена. Осу­ществление такой работы определяется крупными дости­жениями в области генетики и химии нуклеиновых кислот. К важнейшим из них относятся: 1) открытие явления рестрикции-модификации ДНК, в результате которого были выделены необходимые ферменты — рестриктазы для получения специфичных фрагментов ДНК; 2) создание методов химического и химико-ферментативного синтеза генов; 3) выявление векторных молекул ДНК, способных перенести в клетку чужеродную ДНК и обеспечить там экспрессию, соответствующих генов; 4) разработка мето­дов объединения фрагментов ДНК из разных источников; 5) разработка методов трансформации у различных орга­низмов и отбора клонов, несущих рекомбинантные ДНК. Совокупность этих достижений и составляет сущность методологии генной инженерии (Алиханян,1985).

Не менее важное значение имеет генная инженерия в качестве мощного инструмента фундаментальных иссле­дований. С ее помощью изучают строение различных геномов, отдельных генов и кодируемых ими продуктов. Генная инженерия помогла раскрыть экзонинтронную организацию эукариотических генов, позволяла понять суть явления непостоянства генома, связанного с при­сутствием мигрирующих генетических элементов у про- и эукариот, открыла принципиально новые возможности для изучения молекулярных основ онтогенеза, наслед­ственных заболеваний, эволюционного происхождения различных организмов. В значительной мере этим успехам генной инженерии способствовало создание банков (или библиотек) генов отдельных организмов, резко облегчаю­щих стратегию поиска индивидуальных генов, исследо­вание их структуры и функции. Получение танков генов включает выделение тотальной ДНК, фрагментацию ее с помощью рестриктаз, присоединение полученных фраг­ментов к векторным молекулам (плазмидного или фагового происхождения) и введение рекомбинантных ДНК в реципиентные бактерии. Эта техника позволяет полу­чить набор клонов бактерий или щтоков гибридных фагов, различающихся по включенным фрагментам ДНК. Необ­ходимые исследователю гены отбирают из таких банков с помощью специально разработанных генетических, био­химических, радиоизотопных и иммунологических методов. Уже в 1974 г. Д. Хогнесс с сотрудниками, создали банк генов D. melanogaster в клетках Е. coli. Вскоре был получен полный банк генов Е. coli, а затем и многих других организмов, включая человека. Последнее откры­вает реальные перспективы для генотерапии наследствен­ных заболеваний человека с целью исправления генети­ческих дефектов.

Потенциальные возможности генной инженерии дейст­вительно очень велики, и их реализация в полной мере дело сегодняшнего дня и ближайшего будущего (Алиханян, 1985).