6.4. Створення партеногенетичних тварин
Під партеногенезомрозуміють розвиток ембріона з жіночої гамети без участі чоловічої статевої клітини, тобто партеногенетичні особини в хромосомах містять тільки гени матері. Таким чином, партеногенез приймає форму безстатевого розмноження у тварин зі статевим способом відтворення.
У біології розмноження тварин розмежовують два різновиди партеногенезу − гіногенез і андрогенез. При гіногенезіспермії проникають в яйцеклітину, але її функція полягає лише в активації яйцеклітини, а ембріон розвивається без участі хромосом спермія. Однак, при гіногенезі спермії можуть внести в ядро яйцеклітинипозахромосомні, у тому числі й спадкоємні фактори, що здатні брати участь в індивідуальному розвитку тварини.
При андрогенезі, на відміну від справжнього партеногенезу, після активації жіночої гамети спермієм весь генетичний матеріал заплідненої яйцеклітини елімінується, і тому ембріон містить лише батьківський набір хромосом. У цьому разі зигота, а потім і ембріон, розвиваються тільки за участю набору хромосом чоловічого ядра (рис. 63).
Рис. 63. Схема отримання різних типів партеногенетичних тварин
У сучасній науковій літературі тварин, отриманих за рахунок партеногенезу, називають партеногенами.
Розрізняють диплоїдну і гаплоїдну форми партеногенезу. За диплоїдного партеногенезу мейоз (тобто редукції числа хромосом) не відбувається, або диплоїдний набір хромосом відновлюється. Відомі два механізми диплоїзації партеногенезу: амейотичний і мейотичний.
За амейотичногопартеногенезу активація яйцеклітин до партеногенезу відбувається на метафазі першого розподілу. Під впливом незвичайних умов на цій стадії мейозу яйцеклітини повністю придушується редукційний розподіл хромосом, потім відбувається другий − екваційний розподіл мейозу розподіл сестринних хроматидів.
У результаті таких процесів формується яйцеклітина з диплоїдним жіночим пронуклеусом. З таких яйцеклітин можуть розвиватися диплоїдні ембріони винятково жіночої статі. Хоча слід мати на увазі, що в ссавців, в тому числі й сільськогосподарських тварин, амейотичний партеногенез невідомий. Однак, при штучному придушенні мейозу є можливість одержання амейотичного партеногенезу, за допомогою якого весь набір генів (за відсутності кросинговеру, або перехрестя хромосом) матері може бути переданий нащадкам.
За мейотичногопартеногенезу мейоз протікає нормально, тобто завершуються обидва розподіли з утворенням жіночого пронуклеусу. Останній поділяється на два гаплоїдні дочірні ядра, які об'єднуються в одне диплоїдне ядро, що забезпечує партеногенетичний розвиток ембріона, а потім і особини по материнській лінії.
У 1886 р. російський біолог А.А. Тихомиров відкрив явище штучного партеногенезу шовковичного шовкопряда. Уперше він експериментально довів, що незапліднена яйцеклітина шовковичного шовкопряда може бути активована до розвитку штучними стимулами, зокрема, розрідженою сірчаною кислотою. Це відкриття стало початком вивчення проблеми партеногенезу. Шовкопряд виявився найбільш придатним об'єктом для вивчення і практичного використання партеногенезу. Б.Л. Астауровим і В.А. Струнниковим було отримано різні варіанти партеногенетичних порід та ліній шовкопряда. Результати цих робіт викликають не тільки великий теоретичний інтерес, а й мають фактичне застосування в промисловому шовківництві.
Природний партеногенез. Природний партеногенез найпоширеніший у комах − палочників, жуків-довгоносиків, а також у ракоподібних і коловерток. Його виявлено також у бджіл (трутні),ос, скельної ящірки, а серед свійських тварин − у індичок. Було помічено, що із незапліднених яєць белтсвилських дрібних білих індичок у деяких випадках (1...4%) можуть розвиватися ембріони. Селекція на підвищення частоти природного партеногенезу виявилася ефективною. У результаті цілеспрямованої селекції частка партеногенетичних яєць, що розвиваються, досягла 42%. Було помічено, що за відсутності відбору лише в поодиноких випадках партеногенетичний розвиток проходить до вилуплення пташенят-партеногенів. За здійснення селекції відсоток ембріонів, що розвиваються до пізніх стадій інкубації, зростає.
Слід зазначити, що всі партеногенетичні ембріони й індиченята, що сформувалися з них, були самцями. Цитогенетичний аналіз показав, що партеногени мали дишюїдний набір хромосом.
З погляду генетики одержання партеногенетичних самців можна пояснити таким чином. В індичок жіноча стать гетерогаметна (ZW). Тому самка має половину ооцитів з Z-статевою хромосомою, а половину − з W-статевою хромосомою. При партеногенетичному розвитку яєць відбувається злиття хромосом в ооцитах з Z-хромосомою, що призводить до утворення зиготи ZZ, з якої і утворюються життєздатні самці з нормальним для них набором статевих хромосом. При подвоєнні хромосом типу W утворюються зиготи, а потім і ембріони з набором хромосом WW, тобто позбавлені Z-хромосоми. Такі особини є нежиттєздатними. Слід підкреслити роль селекції в створенні партеногенетичних тварин і ліній. У згаданій породі індичок у результаті партеногенетичного розвитку із заплідненого яйця було отримано диплоїдного індика, який став батьком 122 нормальних індичат. Однак спонтанний партеногенез є лише винятком у розмноженні тварин. Навіть у наведеному прикладі з індиками природний партеногенез не можна розглядати як нормальний статевий процес.
Штучний партеногенез. На базі сучасної біотехнології можуть бути розроблені ефективні методи, що викликають штучний партеногенез шляхом стимуляції партеногенетичного розвитку яйцеклітини. Найбільший інтерес викликає індукований партеногенез у ссавців. Однак, у цього класу тварин це пов'язано з великими труднощами через особливості оогенезу. Справа в тому, що у ссавців, як правило, яйцеклітини овулюють на стадії метафази II. Тому партеногенетичному розвитку можуть бути піддані лише зрілі ооцити. Лише у 70-і роки, з розробкою методів культивування й запліднення фолікулярних ооцитів іп vitro, почалися широкі дослідження стимуляції партеногенезу в ссавців, у тому числі у великої рогатої худоби. Як стимулятори, що викликають партеногенетичний розвиток яйцеклітини, використовують механічні, фізичні, хімічні й біологічні фактори.
Активація ооцитів тварин призводить до різних шляхів партеногенетичного розвитку (рис. 64). Наведемо деякі приклади:
Завершення другого мейотичного поділу може призвести до виділення одного гаплоїдного набору хромосом у вигляді полярного тільця і формування єдиного пронуклеуса з іншого. Потім у гаплоїдному пронуклеусі відбувається реплікація ДНК, і яйцеклітина поділяється на два бластомери з гаплоїдними наборами хромосом. Ці зародки називають генетично однорідними гаплоїдами, тому що їх гомологічні хромосоми генетично ідентичні;
Ооцит, завершивши перший розподіл дозрівання, замість утворення другого полярного тільця (тобто минаючи другий мейотичний розподіл), вступає в дроблення − поділяється на дві однакові за розмірами гаплоїдні клітини, у кожній з яких формується пронуклеус (негайне дроблення). Внаслідок того, що розподіл відбувається після кросинговеру і обидва гаплоїдних набори не є генетично ідентичними, зародки називають мозаїчними гаплоїдами;
Після метафази другого розподілу дозрівання і розбіжності хромосом цитотомія не здійснюється (друге полярне тільце не виділяється), внаслідок чого відбувається формування двох гаплоїдних пронуклеусів. Після цього в одних випадках ооцит поділяється на два бластомери -мозаїчний гаплоїд, а в інших, після реплікації ДНК, формування метафазної пластинки і розподілу дроблення, розвивається гетерозиготний партеногенетичний диплоїд (гетерозиготність обумовлена кросинго-вером);
Ооцит не проходить другого розподілу дозрівання і хромосомиформують один великий диплоідний пронуклеус. Післяреплікації ДНК і наступного дроблення утворюютьсягетерозиготний (наслідок кросинговера) партеногенетичнийдиплоїд;
Відбувається нормальний мейоз із двома розподілами, післячого гаплоїдний набір хромосом яйцеклітини формує єдинийпронуклеус, який після подвоєння свого хромосомного набору поділяється на два гаплоїдних ядра. Ці ядра зливаються, утворюють одне диплоїдне ядро, розвивається гомозиготний диплоїд. Різновидом цього шляху розвитку, що властивий шовковичному шовкопрядові, є утворення диплоїдного пронуклеуса в яйцеклітині ссавця після мікрохірургічного видалення чоловічого пронуклеуса і штучної диплоїдизації жіночого пронуклеуса зиготи, що залишився;
. Цілком придушується редукційний розподіл або виділення першого полярного тільця (в останньому випадку хромосоми полярного тільця поєднуються з хромосомами ооциту). Далі відбувається розподіл, що призводить до розбіжності сестринних хроматид. Внаслідок цього в шовковичного шовкопряда утворюються два генетично ідентичних диплоїдних пронуклеуси (у деяких представників гетерогаметної статі), з одним із яких пов'язаний подальший розвиток: після реплікації ДНК яйцеклітина поділяється на два бластомери, кожний з яких містить диплоїдний набір хромосом. Розвивається гетерозиготний партеногенетичний диплоїд, генотип якого ідентичний генотипові матері (амейотичний партеногенез). Крім названих шляхів розвитку стимульованих до партеногенезу ооцитів є й інші. Так, у деяких яйцеклітин утворюється три пронуклеуси, може мати місце тетраплоїдний партеногенез, гаплоїдний зародок може перетворюватися в гаплодиплоїдний та ін.
Одержання того або іншого типу партеногену обумовлене стадією оогенезу, на якій здійснюється активація ооцита, типом активуючого фактора, інтенсивністю впливу і тим поживним середовищем, у якому культивувалися яйцеклітини після активації.
Змінюючи ці фактори, можна спрямувати отримання партеногену того або іншого типу.
У більшості випадків, як показали дослідження, за оптимальних умовах активації розвивається один тип партеногенів − однорідні гаплоїди, тобто яйцеклітини, що виділили після активації друге полярне тільце і мають один гаплоїдний пронуклеус. У такому гаплоїдному пронуклеусі здійснюється редуплікація ДНК і яйцеклітина розподіляється на два бластомери з гаплоїдним набором гомологічних хромосом. Інакше кажучи, цей шлях партеногенетичного розвитку яйцеклітин дозволяє отримати гомозиготних особин протягом одного покоління.
Рис. 64. Шляхи партеногенетичного розвитку з урахуванням трьох перемінних: першого та другогополярного тільця і першого дроблення (заВеайу, 1957)
Посилення інтенсивності впливу факторів, що активують, призводить до збільшення частоти мозаїчних гаплоїдів і обох типів диплоїдних партеногенетичних зародків.
У наш час випробувано багато агентів, здатних активувати яйцеклітини ссавців до партеногенетичного розвитку. Як стимулятори використовують механічні впливи, тепловий, електричний або осмотичний шок, ферменти (гіалуронідаза, трипсин, проназа), двовалентні катіони, антисептики (етанол, дибукаїн, тетракаїн, лигнокаїн, прокаїн), фенотіазинові транквілізатори, інгибітори синтезу білків.
Стимуляція електричним або температурним шоком є найбільш ефективною як іп vitro, так і іп vivo. Електричний струм активує до партеногенезу близько 3/4 свіжоовульованих яйцеклітин, 90% з яких досягає стадії морули або бластоцисти. Температурні впливи стимулюють до 90... 100% яйцеклітин. При застосуванні осмотичного шоку активованих яйцеклітин було значно менше − 38.. .58%.
Є передумови одержання партеногенів і на більш ранніх стадіях стимуляції яйцеклітини ссавців. Цей підхід можливий в умовах культивування ооцитів іп vitro. Виділені з яєчників ооцити можна культивувати до стадій метафази І і метафази II, після чого їх стимулюють до партеногенетичного розвитку з наступним культивуванням і трансплантацією реципієнтам.
Ооцити, що є на різних стадіях мейотичного дозрівання, стимулювалися до партеногенетичного розвитку холодовим шоком за температури 0...4°С протягом 15...36 хв. Потім клітини прогрівали протягом 5 хв. за температури 37,5°С у звичайному середовищі культивування. Після прогрівання ооцити культивувалися у звичайних середовищах. Тривалість культивування ооцитів і зародків -69... 73 год.
Ознаками партеногенетичного розвитку були: виділення полярного тільця, утворення пронуклеусів, синкаріону, першої метафазної пластинки мітозу, дроблення клітин. Результати проведених досліджень показали, що при стимуляції ооцитів до партеногенезу на різних стадіях мейозу найвищий ефект спостерігається за їх активування на метафазі II.
Частка активованих до партеногенетичного розвитку ооцитів, що оцінювалась за виділенням другого напрямного тільця, утворенням пронуклеусів і проходженням першого розподілу дроблення, становила 56,4%. Цитогенетичний аналіз виявив наявність ядер у бластомерах. Цікавим було те, що холодовий шок на стадії метафази IIпризводив до мейотичного, а на метафазі І як до мейотичного, так і до амейотичного партеногенезу.
У великої рогатої худоби мейотичний партеногенез дозволить отримати майже повністю гомозиготних нащадків. За амейотичного партеногенезу, коли активування ооцитів до розвитку відбувається на метафазі І, є можливість майже повністю повторити генотип матері вїї нащадках.
Короткочасний вплив на свіжоовульовані ооцити миші 7-процентним розчином етилового спирту протягом 1, 3 і 5 хвилин викликає однаково високу частоту партеногенетичної активації -64,6; 69,5 і 63,7%, відповідно.
У дослідах виявлена чітка залежність інтенсивності дії етанолу від його концентрації і температури середовища під час активації. Показано, що максимальне число яйцеклітин активується 4-процентним етанолом за температури 33,2°С, а при 7-процентній його концентрації активізуючий вплив найбільш повно виражений за температури 24,5°С. Після трансплантації активованих яйцеклітин реципієнтам зародки до 72...96год.досягали стадії морул ібластоцист.
Найбільший інтерес викликає застосування біологічних факторів, оскільки їх дія може зберігатися і у наступних поколіннях. Ефект інфікування курей та індичок вірусом саркоми Рауса або вірусом віспи птиці зберігається протягом двох поколінь і виявляється в збільшенні до 25% числа знесених яєць, здатних до партеногенетичного розвитку. Для викликання партеногенетичного активування дозрілих іп vitroооцитів великої рогатої худоби також використовують біологічні методи (віруси саркоми Рауса й віспи птиці, запліднення сперматозоїдами інших видів ссавців).
Досліди на мишах показали, що партеногенетичні зародки здатні у своєму ранньому ембріональному розвитку завершити передімплантаційну стадію, тобто утворити бластоцисти. Однак, партеногенетичні бластоцисти здебільшого не можуть імплантуватися або гинуть на початкових стадіях постімплантаційного періоду.
Шляхом аналізу динаміки розвитку партеногенетичних зародків було виявлено, що вже на самих ранніх стадіях ембріогенезу партеногени розвиваються слабкіше за запліднені яйцеклітини. Ця різниця зростає і далі аж до імплантації. Причому така закономірність характерна для всіх типів партеногенетичних зародків. Однак, слід зазначити, що диплоїдні иартеногенетичні зародки розвиваються краще і гинуть пізніше гаплоїдних. Морфологічні і гістологічні дослідження показали, що паргеногенетичні, особливо гаплоїдні бластоцисти, нерідко відрізняються значними відхиленнями від норми. Це негативно позначається не тільки на розвитку партеногенетичних зародків, а й на результатах їхньої імплантації.
Дотепер механізм загибелі партеногенетичних зародків у ссавців не з'ясований. Висловлено припущення, що загибель викликана порушенням темпів дроблення, формуванням неповноцінних бластоцист, десинхронізацією процесів, що протікають у стінці слизової матки та в трофоектодермі при введенні зародка в слизову матки.
А.П. Дибан і Е.М. Ноніашвілі (1986) припускають, що загибель партеногенетичних зародків мишей може бути викликана нестабільністю їхнього каріотипу, появою хромосомних аберацій, а також обумовлюватися рецесивними летальними мутаціями, ефект яких проявляється в гемізиготному стані алелів у гаплоїдів. Ці ж автори, узагальнивши великий літературний матеріал, указують на дві основні гіпотези загибелі постімплантаційних партеногенетичних зародків.
Відповідно до першої − за активації яйцеклітини до партено-генетичного розвитку її цитоплазма стає неповноцінною.
На підставі останніх експериментів і теоретичного аналізу отриманих результатів була сформульована друга гіпотеза, що має все більше визнання. Останнім часом у дослідах з реципрокними пересадженнями пронуклеусів між зиготами миші було показано, що у ссавців для завершення ембріогенезу необхідні як чоловічий, так і жіночий пронуклеуси.
Класичні досліди М. Сурані зі співавторами, проведені на мишах, показали, що ні подвійна доза материнських генів (партеногенетичні ембріони), ні подвійна доза батьківських генів (андрогенетичні ембріони), ні наявність у ембріонів дишюїдних одноматеринських і однобатьківських клітин недостатні для нормального ембріонального розвитку, що для завершення ембріогенезу клітина повинна мати і материнські, і батьківські хромосоми.
Було показано, що чоловічий геном необхідний для утворення позазародкових тканин, а жіночий − для проходження визначенихстадій ембріогенезу. В роботі, проведеної також на мишах, показано, що чоловічий геном необхідний для розвитку трофектодерми (ТЕ) і надалі − плаценти, але до 8-клітинної стадії участь батьківського генома в повноцінному розвитку мишачих ембріонів не обов'язкова. Гаплоїдний набір недостатній для проліферації клітин, тому виживають тільки диплоїдизовані клітини. Нормальний розвиток ембріонів можливий лише в тому випадку, якщо бластоцисти містять як клітини внутрішньої клітинної маси (ВКМ), так і клітини трофектодерми. Це пояснюється тим, що клітини ВКМ і ТЕ відрізняються низкою властивостей. Клітини ТЕ під індукційним впливом ВКМ проліферують і з них утворюються позазародкові тканини, коли клітини ВКМ не утворюють зародкових оболонок, а формують тіло зародка, тобто його тканини і органи.
Незважаючи на проведені дослідження, механізм партеногенетичного розвитку у великої рогатої худоби ще не повністю розпізнаний. Тільки остаточне вивчення механізму партеногенетичної активності ооцитів сприятиме розробці надійного методу клонування, одержання майже повністю гомозиготних нащадків (мейотичний партеногенез) або генетичних копій матері (амейотичний партеногенез). За допомогою клонування можливо буде прискореними темпами створити генетичні лінії в племінному скотарстві і популяції ідентичних особин з необхідними генотипами для ефективного виробництва молока і м'яса в промисловому скотарстві.
Дуже важливим за клонування тварин є амейотичний партеногенез, що дозволяє практично без змін повторювати цінний генотип матері в її потомстві. Можливість одержання тільки жіночих особин, наприклад, у великої рогатої худоби, що в поєднанні із кращими продуктивними якостями, як повторюються в наступних поколіннях, значно спрощує селекцію. Комплексне використання методів партеногенетичного розвитку яйцеклітин і їхньої трансплантації дозволяє перевести відтворення високопродуктивних тварин на промислову основу, що має велике господарське значення.
Стимуляція партеногенетичного розвитку дає можливість у перспективі одержувати величезну кількість гомозиготного або одноманітного за генотипом потомства. Це дозволить у найкоротший термін різко підвищити продуктивність тварин і одержувати особин бажаної статі. Створення черід із клонованих тварин буде сприяти розвитку промислового тваринництва. Тварин одного генотипуможна утримувати на однаковому раціоні, непотрібно здійснювати селекцію за екстер'єром, реакціями поведінки, вименем й іншими ознаками. Полегшується розробка питань машинного доїння, норм годівлі. Створений доїльний апарат для однієї корови буде придатним для всіх її генетичних аналогів.
Таким чином, створення клонів тварин можна розглядати як ефективну біотехнологію майбутнього племінного і користувального скотарства.